Vi præsenterer her, en metode til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila ved at erstatte den første kodning exon af gener med transskription drivere. CRISPR/Cas9-baseret metode placerer en transaktivatoren sekvens under den endogene regulering af et afløste gen, og derfor letter transctivator udtryk udelukkende i gen-specifikke spatiotemporelle mønstre.
Binære transskription systemer er stærke genetiske værktøjer bruges til visualisering og manipulere celle skæbne og gen udtryk i bestemte grupper af celler eller væv i modelorganismer. Disse systemer indeholder to komponenter som separate transgene linjer. En driver linje udtrykker en transcriptional aktivator under kontrol af væv-specifikke initiativtagerne/smagsforstærkere, og en reporter-effektor linje havne et target gen placeret nedstrøms til bindingssted af transkription aktivere. Dyr husly begge komponenter fremkalde væv-specifikke transactivation for en target genekspression. Præcise spatiotemporelle udtryk af genet i målrettet væv er kritisk for objektiv fortolkning af celle-genet aktivitet. Derfor er udvikle en metode til at generere eksklusive celler/væv-specifik driver linjer afgørende. Her præsenterer vi en metode til at generere meget væv-specifikke målrettede udtryk systemet ved at ansætte en “grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske Repeat/CRISPR-forbundet” (CRISPR/Cas)-baseret genom-redigering teknik. I denne metode guide liv1975 Cas9 er målrettet to kimære RNA’er (gRNA) til bestemte websteder i den første kodning exon af et gen i Drosophila genom oprette dobbelt-strenget pauser (DSB). Efterfølgende, kan ved hjælp af en udefrakommende donor plasmid som indeholder transaktivatoren sekvens, celle-selvstændig reparation maskiner homologi-instrueret reparation (HDR) af DSB, hvilket resulterer i præcise fjernelse og udskiftning af exon med transaktivatoren sekvens. Bankede i transaktivatoren er udtrykt udelukkende i celler hvor cis-regulerende elementer af udskiftede genet er funktionelle. Detaljerede trinvise protokollen præsenteres her til at generere en binær transcriptional driver udtrykt i Drosophila fgf/forgreningsløse-producerer epitelial/neuronale celler kan vedtages for enhver gen – eller væv-specifikke udtryk.
Den genetiske værktøjskasse til målrettede genekspression har været veludviklet i Drosophila, hvilket gør det en af de bedste model til at undersøge funktionen af gener involveret i en bred vifte af cellulære processer. Binært udtryk systemer, såsom gær Gal4/UAS (opstrøms aktivering sekvens), blev først vedtaget for væv-specifikke enhancer diffusering og gene misexpression i Drosophila genetiske model1 (figur 1). Dette system fremmet udviklingen af en lang række teknikker som spatiotemporelle regulering af genet overekspression, misexpression, knockout i udvalgte grupper af celler samt som celle ablation, celle mærkning, live sporing af cellulære og molekylære processer i embryo og væv, afstamning sporingen og mosaik analyser under udvikling. En række binære transskription system, såsom den bakterielle LexA/LexAop system (figur 1) og Neurospora Q-system, er stærke genetiske værktøjer, der er nu udbredt i Drosophila, ud over den oprindelige Gal4/UAS system for målrettede gen expression1,2,3.
Vi præsenterer her, en metode til at generere meget pålidelige væv-specifikke binære udtryk systemet ved at ansætte en genom-redigering teknik. De seneste fremskridt i CRISPR/Cas9 genom redigering teknologi har tilladt hidtil usete muligheder for at gøre styret genom ændringer i en bred vifte af organismer. I forhold til de andre tilgængelige genom redigering teknikker, er CRISPR/Cas9-systemet billig, effektiv og pålidelig. Denne teknologi anvender komponenter af den bakterielle adaptive immunsystem: en Cas9 liv1975 af Streptococcus pyogenes , der skaber en dobbelt-strenget pause (DSB) og en kimære guide-RNA (gRNA), som guider Cas9 for et websted til et bestemt genom målrettet DSB4. Cellerne indeholder maskineri for at reparere DSB ved hjælp af forskellige veje. Ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) fører til små indrykninger eller sletninger at forstyrre genfunktion, mens homologi-instrueret reparation (HDR) indfører en defineret instrueret/ønskeligt genomisk knock-i/knock-out ved hjælp af en udefrakommende HDR donor som en skabelon. Den HDR-baserede udskiftning strategi udnyttes effektivt for at generere en yderst pålidelig væv-specifikke binære udtryk system, som kan overvinde begrænsningerne af traditionel forstærker fælde metoder. Vi beskriver en trinvis fremgangsmåde for udnyttelse af CRISPR/Cas9-baserede HDR reparation til at generere en binær transskription driver linje, der kommer til udtryk under kontrol af endogene transcriptional og post-transcriptional regulering af en Drosophila gen. I denne protokol, vi vise generation af en specifik for driveren forgreningsløse (bnl) gen kodning en FGF familie protein, der regulerer forgrening morfogenese af luftrør luftvejene epitel5. I dette eksempel, den første kodning exon af bnl genet blev erstattet af rækkefølgen af en bakteriel LexA transaktivatoren sekvens uden at ændre nogen endogene cis-regulerende sekvenser af bnl genet. Vi viser, at strategien genereret en bnl-LexA driver linje, der spatiotemporally styrer udtryk af en reporter gen placeret neden for LexAoperator (LexAop eller LexO) udelukkende i bnl- at udtrykke epitelial/mesenchymale/neuronale celler.
Traditionelt, blev Drosophila enhancer fælder genereret af to forskellige metoder. En af måder omfatter tilfældige indsættelse af en driver (fx., Gal4) sekvens i genomet af gennemførelse (fx., P-element gennemførelse)1 . Alternativt, driver sekvenser kan placeres under transcriptional kontrol af en formodede forstærker/promotor-regionen i en plasmid konstruktion, som ville derefter integreres i en ektopisk site af genom3,<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Dr. F. Port, Dr. K. O’Connor-Giles og Dr. S. Feng for drøftelser om CRISPR strategi; Dr. T.B. Kornberg og Bloomington Stock Center for reagenser; UMD imaging core facilitet; og midler fra NIH: R00HL114867 og R35GM124878 til SR.
X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecolare |
EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecolare |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecolare |
UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecolare |
10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologia Molecolare |
KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologia Molecolare |
EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologia Molecolare |
GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
Primers | IDT-DNA | PCR | |
pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecolare |
2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecolare |
Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologia Molecolare |
TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologia Molecolare | |
Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologia Molecolare |
OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologia Molecolare |
lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |