Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

التوليف وتصميم هيكل الايزومرات بييا μ-كونوتوكسين مع Connectivities ثنائي كبريتيد مختلفة

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58368
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

إضعاف الببتيدات سيستين الغنية في هياكل ثلاثية الأبعاد مميزة اعتماداً على اتصال ثنائي كبريتيد. مطلوب توليف المستهدفة من ايزومرات ثنائي كبريتيد الفردية عند أكسدة العازلة لا يؤدي إلى اتصال ثنائي كبريتيد المرجوة. ويتناول البروتوكول التوليف انتقائية من الببتيدات 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين والتحليل الهيكلي استخدام دراسات الرنين المغناطيسي النووي و MS/MS.

Abstract

عادة ما تتأثر الببتيدات مع عدد كبير من سيستينيس فيما يتعلق بهيكل ثلاثي الأبعاد باتصال ثنائي كبريتيد بهم. أنه هكذا هو بالغ الأهمية لتجنب تشكيل السندات ثنائي كبريتيد غير مرغوب فيها أثناء التوليف الببتيد، لأن ذلك قد يؤدي في بنية ببتيد مختلفة تماما، ونتيجة لذلك تعديل بيواكتيفيتي. غير الصحيح تشكيل السندات ثنائي كبريتيد متعددة في ببتيد يصعب الحصول عليها باستخدام أساليب ذاتية قابلة للطي القياسية مثل بروتوكولات أكسدة العازلة التقليدية، لأنه يمكن أن تشكل عدة ثنائي كبريتيد connectivities. ويمثل هذا البروتوكول استراتيجية متقدمة اللازمة لتركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد المتعددة التي لا يمكن تجميعها عن طريق الأكسدة العازلة عالية الجودة والكمية المستهدفة. الدراسة يوضح تطبيق استراتيجية مجموعة حماية متميزة لتوليف جميع ايزومرات الببتيد ممكن 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين بييا μ-كونوتوكسين بطريقة هادفة. الببتيدات يعدها توليف الببتيد المرحلة الصلبة المستندة إلى معتدلاً باستخدام استراتيجية مجموعة حماية لتشكيل ثنائي كبريتيد تعريف السندات. محمية أزواج كل منها من سيستينيس مع تريتيل (حزب تاي راك تاي)، أسيتاميدوميثيل (الأسبستوس) و ثالثي-بوتيل (تيبو) حماية المجموعات للتأكد من أن ديبروتيكتيد ومرتبطة فقط حاجة سيستينيس خلال كل خطوة الأكسدة. بالإضافة إلى توليف المستهدفة، يستخدم مزيجاً من عدة أساليب تحليلية لتوضيح الصحيح للطي وإنشاء هياكل الببتيد المرجوة. المقارنة بين الايزومرات المستعبدين من ثنائي كبريتيد 3 مختلفة تشير إلى أهمية تحديد دقيق والمعرفة باتصال ثنائي كبريتيد لحساب هيكل ثلاثي الأبعاد وتفسير البيولوجية النشاط ايزومرات الببتيد. ويشمل وصف تحليلي استجلاء هذه السندات ثنائي كبريتيد الدقيق عن طريق تحليل الطيف الكتلي (MS/MS) جنبا إلى جنب التي تتم مع مشتقات جزئيا انخفاض ويؤلكل أيسومر الببتيد سليمة تنتجها بروتوكولا تكييف. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد هياكل الببتيد استخدام 2D الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) التجارب والمعارف التي تم الحصول عليها من تحليل MS/MS.

Introduction

استخدام الببتيدات النشطة بيولوجيا في البحوث الصيدلانية والتنمية هو تقديراً كبيرا، لأنها تمثل مركبات قوية وانتقائية للغاية لأهداف بيولوجية محددة1. لما بيواكتيفيتي، هيكل ثلاثي الأبعاد غير ذات أهمية كبيرة من أجل تنفيذ الهيكل والنشاط العلاقة دراسات2،،من34. وبصرف النظر عن تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية التي تؤثر على تكيف عموما، استقرار السندات ثنائي كبريتيد إلى حد كبير هيكل الببتيدات الغنية سيستين5. وتشمل متعددة الببتيدات سد ثنائي كبريتيد والكونوتوكسين استيفاء مثل μ-بييا من أرجواني كونوس الذي يحتوي على ستة سيستينيس التسلسل. ويسمح هذا المحتوى سيستين عالية نظرياً تشكيل 15 ثنائي كبريتيد الايزومرات. اتصال ثنائي كبريتيد الصحيحة مهم جداً لأن النشاط البيولوجي6،7. بيد أن السؤال الذي يطرح نفسه ما إذا كان هناك أكثر من تكيف النشطة بيولوجيا الببتيدات التي تحدث بشكل طبيعي، وإذا كان ذلك، الذي هذه الايزومرات يمتلك النشاط البيولوجي أعلى؟ وفي حالة μ-والكونوتوكسين استيفاء، الأهداف البيولوجية بقنوات أيون الصوديوم عن طريق بوابة الجهد، و μ-بييا على وجه الخصوص أقوى للأنواع الفرعية ناV1.2، ناV1.4 و NaV1.73.

يمكن تركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد باستخدام أساليب مختلفة. الأسلوب الأكثر ملاءمة لتشكيل ثنائي كبريتيد السندات داخل ببتيد هو ما يسمى بالنهج الذاتي للطي الأكسدة. هنا، يتم تصنيعه السلائف الخطي من الببتيد دوري المطلوب أولاً باستخدام الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف، بعد انشقاق من دعم البوليمرية يتعرض للأكسدة في نظام المخزن مؤقت. غالباً ما يتم إضافة عوامل الأكسدة النشطة مثل انخفاض والمؤكسدة الجلوتاثيون (المدفع جريازيف/جسج) تشجيع تشكيل روابط ثنائي كبريتيد. والعيب الرئيسي في دعم المخزن المؤقت الذاتي قابلة للطي أن السندات ثنائي كبريتيد تتشكل ليس انتقائيا بشكل تدريجي. الببتيد الأصلية، التي غالباً ما يوصف ايزومير ثنائي كبريتيد محدد واحد فقط، بالمقارنة مع الممكن الحصول على العديد من الايزومرات الأخرى مع هذا النهج8. وقد أثبت بالفعل μ-بييا أن يؤدي على الأقل ثلاثة ايزومرات مطوية بشكل مختلف عند طي ذاتيا في دراسة سابقة3. بدلاً من ذلك صعباً نتيجة مماثلة مرات الاحتفاظ بفصل هذه أن خليط ايزومير إذا استخدام أساليب تنقية الكروماتوغرافي9. ولذلك توليف ايزومير محددة مستهدفة مفيد. لإنتاج على وجه التحديد أيسومر مع اتصال ثنائي كبريتيد محددة، استراتيجية خاصة مطلوب في فيها سندات ثنائي كبريتيد تباعا مغلقة. ولذلك، يتم تصنيعه السلائف خطية تحمل مجموعات حماية متميزة في أزواج سيستين الفردية في دعم البوليمر. بعد القضاء على، أزواج سيستين فردياً وتباعا ديبروتيكتيد وترتبط بفعل أكسدة لإنتاج ثنائي كبريتيد المطلوب سندات10،11،،من1213، 14 , 15 , 16-بعد التوليف وتنقية المنتج رد فعل، أنه مطلوب لتأكيد الهوية والاتصال ثنائي كبريتيد بالطرق التحليلية المناسبة. وتتوفر العديد من الأساليب التحليلية لتوضيح تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية، على سبيل المثال-، MS/MS، حين تحديد اتصال ثنائي كبريتيد لا يزال أقل بكثير من التحقيق. وبصرف النظر عن الطابع المعقد لهذه الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد متعددة، الشوائب المتعلقة بالمنتج (على سبيل المثال.، من ثنائي كبريتيد الهرولة)، نظراً لنموذج إعداد ومتابعة أعمال يمكن أن تزيد من تعقيد التحليل. في هذه الورقة، ونحن تبين أن استخدام مزيج من التقنيات التحليلية المختلفة اللازمة لتوضيح هوية السندات ثنائي كبريتيد في ايزومرات μ-بييا لا لبس فيه. لدينا طرق الكروماتوغرافي جنبا إلى جنب مع الطيف الكتلي وقدمت نفس العينات للتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. وفي desorption/ionization(MALDI) الليزر ساعد مصفوفة تحليل MS/MS، حددنا السندات ثنائي كبريتيد باستخدام الحد الجزئي و derivatization إيودواسيتاميدي لأنه ليس من الممكن لهذا الببتيد التحليل من أعلى إلى أسفل. 2D الرنين المغناطيسي النووي تجارب أجريت من أجل الحصول على هيكل ثلاثي الأبعاد لكل أيزومر. وهكذا، عن طريق الجمع بين أساليب تحليلية متطورة متميزة، فمن الممكن توضيح بشكل صحيح اتصال ثنائي كبريتيد وبنية ثلاثية الأبعاد معقدة متعددة الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: جميع الأحماض الأمينية المستخدمة هنا كانت في لالتكوين. استخدمت المختصرات من الأحماض الأمينية ومشتقات الأحماض الأمينية طبقاً لتوصيات اللجنة التسميات من أيوب واللجنة المشتركة البحتة-أيوب في "مصطلحات الكيمياء الحيوية".

1-المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (الكائنة)

ملاحظة: إجراء التوليف مع المزج ببتيد المرحلة الصلبة. إجراء توليف السلائف الببتيد الخطي في التسلسل العام زرلككجفوكسكرسرقكوهركك-NH2 باستخدام بروتوكول قياسي للكيمياء 9-فلورينيلميثيلوكسيكاربونيل (معتدلاً). تطبيق الأحماض الأمينية المحمية التالية: Pyr (بنك الصين (ثالثي-بوتيلوكسيكاربونيل))، الأرجنتين (Pbf (2,2,4,6,7-بينتاميثيلديهيدروبينزوفوران-5-السلفونيل))، Asn(Trt)، Asp(tBu)، Hyp(tBu)، Lys(Boc)، Ser(tBu)، Gln(Trt)، Glu(tBu)، Trp(Boc)، Tyr(tBu)، Thr(tBu)، وله (حزب تاي راك تاي). حماية أزواج سيستين مع حزب تاي راك تاي-Acm-أو تيبو-مجموعات وفقا لاتصال ثنائي كبريتيد المقصود.

  1. إعداد
    1. جاف الراتنج معتدلاً حلبة-أميد (تحميل: 0.28 mmol/ز) استخدام ليوفيليزير بين عشية وضحاها.
    2. أدخل التسلسل المطلوب الببتيد (1-رسالة التعليمات البرمجية) إلى برنامج المزج. البرنامج يقوم بحساب المبلغ المطلوب لكل كاشف الفردية وتشير إلى كميات المذيبات.
    3. وزن الكواشف الفردية (الأحماض الأمينية، هبتو (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium سداسي فلوروفوسفات)) وفقا للبروتوكول ويحل لهم في dimethylformamide (DMF) إلى نهائي تركز 2.4 م (الأحماض الأمينية) و (0.6 م هبتو)، على التوالي.
    4. نقل الكواشف المختلفة (الأحماض الأمينية، هبتو، ميثيلمورفوليني ن (نم، 50% في DMF)، بيبيريديني (20% في DMF)، DMF، الميثان (DCM)) بسفن المقابلة ووضعها في مضارب المناسبة من المزج الببتيد المرحلة الصلبة.
    5. إضافة 100 مغ راتنج الجافة إلى أعمدة رد الفعل ووضعها في مضرب المزج. بدء تركيب الببتيد المرحلة الصلبة.
  2. الكائنة--البروتوكول (التي قدمها المزج)
    ملاحظة: ينطبق البروتوكول على 100 مغ راتنج (تحميل: 0.28 mmol/g) إضافة إلى عمود واحد رد فعل لمقياس µmol 28.
    1. إعداد الراتنج
      1. شطف الراتنج مع 2500 ميليلتر DMF وميليلتر 1400 من DCM 1400 ميليلتر من DMF.
      2. مسح الراتنج مع الهواء حتى تتم إزالة المذيب وشطف الراتنج مع 2500 ميليلتر من DMF.
    2. انشقاق معتدلاً حماية المجموعة
      1. إضافة 20% بيبيريديني في DMF (1000 ميليلتر) إلى الراتنج وانتظر دقيقة 6 إزالة الحل من الراتنج. كرر الخطوة 1.2.2.1.
      2. شطف مرتين مع DMF (1st 4000 ميليلتر، 2nd1400 ميليلتر) ومسح الراتنج مع الهواء حتى تتم إزالة المذيب وشطف مرتين مع 2000 ميليلتر من DMF.
    3. رد فعل اقتران
      1. مزيج الكواشف التالية في قنينة منفصلة: هبتو (450 ميليلتر؛ M 0.6 في DMF؛ µmol 270؛ 9.6 مكافئ.)، نم (125 ميليلتر؛ 50% في DMF؛ µmol 568؛ 20 مكافئ.)، الأحماض الأمينية معتدلاً (420 ميليلتر؛ 2.4 متر في DMF؛ ملمول 1.01؛ 36 مكافئ.). إضافة الخليط إلى الراتنج وانتظر 13 دقيقة إزالة الحل من الراتنج. كرر الخطوة 1.2.3.1.
      2. يغسل مع 3000 ميليلتر من DMF. تغسل مرتين مع 1400 ميليلتر من DMF. تغسل مرتين مع 2000 ميليلتر من DMF.
      3. كرر الخطوتين 1.2.2 و 1.2.3 وفقا لعدد الأحماض الأمينية في تسلسل الببتيد.
    4. أغسل الانقسام وراتنج معتدلاً النهائي
      1. إضافة 20% بيبيريديني في DMF (1000 ميليلتر) إلى الراتنج وانتظر دقيقة 6 إزالة الحل من الراتنج. كرر الخطوة 1.2.4.1.
      2. شطف مرتين مع DMF (1st 4000 ميليلتر، 2nd 1400 ميليلتر) وتدفق الراتنج مع الهواء. شطف مرتين مع 2000 ميليلتر من DMF، 4 مرات مع ميليلتر 1400 من DCM، ومطاردة مرتين مع الهواء.
  3. متابعة العمل
    1. ليوفيليزي الراتنج من رد فعل الأعمدة بين عشية وضحاها بعد إتمام التوليف.

2-الببتيد الانقسام من الراتنج (الشكل 1أ)

ملاحظة: أثناء عملية الانقسام، وسوف ديبروتيكتيد جميع سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية باستثناء Cys(Acm) و Cys (تيبو). ينطبق البروتوكول على 100 مغ راتنج.

  1. الجمع بين الراتنج المعصوفه في أنبوب 12 مل وبارد إلى 0 درجة مئوية على الجليد.
  2. إضافة 150 ميليلتر من خليط الكاسح (أعد من الفينول ز 0.75، ثيوانيسولي مل 0.5، 0.25 مل اثانيديثيول) و 1 مل من حامض trifluoroacetic (تفا، 95% في الماء (H2O)) على الجليد إلى الراتنج. ترك تهتز برفق ح 3 في درجة حرارة الغرفة.
  3. تصفية هذا الخليط عن طريق أطل زجاج وجمع فيلتراتي في أنابيب مليئة فردياً المثلج إثيل الاثير (1 مل مزيج الانقسام في 8-10 مل أثير ثنائي إثيل). الببتيد رواسب صلبة بيضاء.
  4. شطف الكعكة تصفية مع تفا إضافية (95% في ح2س، حوالي 1-3 مل).
  5. إغلاق الأنابيب التي تحتوي على ترسبات الطرد المركزي (3400 س ز) أن الإيقاف لمدة 1 دقيقة، صب المادة طافية وتغسل الكريات مع 8-10 مل من المثلج إثيل الاثير. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
  6. اترك الكريات الدائمة دون سداده لمدة 5 دقائق لإزالة بقايا إثيل الاثير. حل الكريات النفط الخام المنتج في 1 مل من ثالثي-butanol (80% في ح2س). فريزيدري الببتيدات (-80 درجة مئوية).

3-تنقية "السلائف الخطي" مع شبه محضرة عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك])

ملاحظة: تنقية الببتيدات الخام خلال المرحلة التحضيرية شبه المعكوسة (RP) [هبلك] مزودة بعمود C18 (5 ميكرون حجم الجسيمات، 100 حجم المسام، 250 × 32 مم) وحلقة حقن 3.6 مل. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في الاسيتو الانيتريل (ميكن)/H2س (الوينت 9:1، ب). الكشف عن قمم 220 نانومتر.

  1. إضافة ما يقارب 70 ملغ الببتيد الخام إلى أنبوب 15 مل وحل الببتيد الصلبة في حجم الحلقة عينة [هبلك] (على سبيل المثال-، 3.6 مل). استخدام خليط من 0.1% تفا ميكن/ح2س (1:1). دوامة حتى إتمام انحلال وأجهزة الطرد المركزي (3400 س ز) الحل لمدة 1 دقيقة.
  2. وضع العينة (3.6 مل) في حقنه 5 مل وحقن العينة دون أي فقاعات الهواء في حلقة الحقن. حقن النظام [هبلك]. فصل الخليط الببتيد استخدام تدرج من 0-50% الوينت ب ما يزيد على 120 دقيقة بمعدل تدفق من 10 مل/دقيقة.
  3. جمع الكسور في أنابيب الفردية كما تظهر. بعد اكتمال التشغيل إعداد الكسور المحدد الكتلي (مللي ثانية) وتحليل [هبلك] (الخطوة 6، 1-6، 2). فريزيدري الكسور وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  4. بعد تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد و [هبلك]، الجمع بين الكسور نقية من الببتيد الخطي وإعداد العينات لأكسدة الأولى.

4-انتقائية تشكيل روابط ثنائي كبريتيد

  1. 1 شارع أكسدة (1 الشكلب)
    ملاحظة: خلال الانقسام الببتيد من الراتنج، Cys(Trt) هي ديبروتيكتيد، مما أدى إلى اثنين من بقايا Cys غير المحمية التي تتعرض فيما بعد للأكسدة لتشكيل أول سند ثنائي كبريتيد. يسري البروتوكول التالي بملغ 15 من الببتيد المنقي الخطي (2864.5 g/mol؛ 5.2 µmol؛ 1 مكافئ.).
    1. حل الببتيد الخطي (15 مجم) في 105 مل من الايزوبروبانول/ح2س-خليط (1:2؛ 0.05 مم؛ الرقم الهيدروجيني 8.5 تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)) وترك تهتز برفق في الجو بالشروط الأساسية ح 12-48.
    2. رصد رد فعل الأكسدة عن طريق [هبلك] والسيدة تأكيد تشكيل أول جسر من إيودواسيتاميدي (IAA) derivatization (الخطوة 6).
    3. فريزيدري الببتيد واستخدامه دون مزيد من تنقية لأكسدة 2nd .
  2. 2nd أكسدة (رقم 1ج)
    ملاحظة: أثناء أكسدة الثاني، deprotection سيستينيس محمية بمواد تحتوي على الأسبستوس، وتشكيل الجسر الثاني هي تحفزها اليود. ويسري البروتوكول بملغ 15 من الببتيد بعد أكسدةش 1 (2862.5 g/mol؛ 5.2 µmol؛ 1 مكافئ.)
    1. حل الببتيد (15 ملغ؛ النهائي تركيز 0.05 مم) في 105 مل من الايزوبروبانول/ح2م O/1 خليط حمض الهيدروكلوريك (HCl) (80:12.5:7.5).
    2. إضافة ميليلتر 158 حلاً اليود 0.1 متر في الميثانول (ميوه) (15.7 µmol؛ 3 مكافئ.) للحل. إثارة رد فعل في درجة حرارة الغرفة ح 3-52، أي.، حتى يتم إكمال الأكسدة.
    3. مراقبة رد فعل الأكسدة عن طريق [هبلك] والسيدة تأكيد تشكيل ثنائي كبريتيد السند الثاني عن طريق إيودواسيتاميدي (IAA) derivatization (الخطوة 6).
    4. وقف رد الفعل بإضافة ميليلتر 79 حل حمض الأسكوربيك 1 م في ح2س (78.8 µmol؛ 15 مكافئ.). فريزيدري الخليط رد فعل واستخدام المسحوق لأكسدة 3rd .
  3. 3rd أكسدة (1 الرقمد)
    ملاحظة: أكسدة آخر يؤدي إلى deprotection سيستينيس محمية بو تيوإلى تشكيل ثنائي كبريتيد الجسر الثالث. ويسري البروتوكول بملغ 15 من الببتيد بعد أكسدة 2nd (2718.3 g/mol؛ 5.5 µmol؛ 1 مكافئ.).
    1. حل الببتيد (15 ملغ، التركيز النهائي من 1 مم) في 5.5 مل تفا. أنه يحتوي على خليط الكاسح يتكون من 11.2 ملغ ديفينيلسولفوكسيدي (55 µmol؛ 10 مكافئ.)، 60.2 ميليلتر انيسول (0.6 ميللي مول؛ 100 مكافئ.) و 97.2 ميليلتر من تريتشلوروميثيلسيلاني (0.8 mmol؛ 150 مكافئ.). يقلب الخليط ح 3-5 في درجة حرارة الغرفة.
    2. مراقبة رد فعل الأكسدة عن طريق [هبلك] والسيدة تأكيد تشكيل السندات ثنائي كبريتيد الثالثة عن طريق إيودواسيتاميدي (IAA) derivatization (الخطوة 6).
    3. يعجل الببتيد في الأنابيب التي تحتوي على البارد إثيل الاثير (0 درجة مئوية، 1 مل من محلول رد فعل كل 8-10 مل أثير ثنائي إثيل).
    4. الطرد المركزي من التعليق (3400 س ز، 1 دقيقة)، وصب المادة طافية، وتغسل الكريات مرارا وتكرارا (4 مرات) مع 8-10 مل أثير ثنائي إثيل الباردة (0 درجة مئوية). واسمحوا الكريات الجافة على الهواء (3 دقائق).
    5. حل الكريات في 1 مل من 80% ثالثي-فريزيدري الببتيد وبيوتانول (في ح2س)، وتخزينها في-20 درجة مئوية.

5-الببتيد تنقية

ملاحظة: تنقية الببتيدات المؤكسدة التي اتخذته شبه [هبلك] RP مزودة بعمود C18 (10 ميكرون حجم الجسيمات، 300 حجم المسام، 250 x 22 مم) وحلقة حقن 3.6 مل. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا ميكن/H2O (الوينت 9:1، ب). الكشف عن قمم 220 نانومتر.

  1. إضافة 15 ملغ المعصوفه النفط الخام المنتج من الخطوة 4.3.5 إلى أنبوب 15 مل. حل النفط الخام المنتج في حجم الحلقة عينة [هبلك] (على سبيل المثال-، 3.6 مل). استخدام خليط من 0.1% تفا ميكن/ح2س (1:1). دوامة حتى إتمام انحلال وأجهزة الطرد المركزي (3400 س ز) الحل لمدة 1 دقيقة.
  2. وضع الخليط 3.6 مل في حقنه 5 مل وحقن العينة دون أي فقاعات الهواء في حلقة الحقن. بدء ضخ في نظام [هبلك]. تنقية خليط الببتيد استخدام تدرج من 0-50% الوينت ب ما يزيد على 120 دقيقة بمعدل تدفق من 10 مل/دقيقة.
  3. جمع الكسور في أنابيب الفردية كما تظهر. بعد اكتمال التشغيل إعداد الكسور المحدد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد و [هبلك] (الخطوة 6، 1-6، 2). فريزيدري كافة الكسور وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  4. بعد اكتمال التشغيل إعداد الكسور المحدد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد و [هبلك] (الخطوة 6، 1-6، 2). فريزيدري كافة الكسور وتخزينها في-20 درجة مئوية.

6-الببتيد تحليلات

  1. [هبلك] تحليلية
    ملاحظة: تأكيد نقاء الببتيد واسطة تحليلية [هبلك] RP مزودة بعمود C18 (5 ميكرون حجم الجسيمات، 300 حجم المسام، مم 250 × 4.6) وحلقة حقن 500 ميليلتر. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في ميكن (الوينت ب). الكشف عن قمم 220 نانومتر.
    1. نقل عينة من الكسور الببتيد أو رد فعل عناصر التحكم إلى [هبلك] فيال وحله في خليط من 0.1% تفا في ميكن/H2O (1:1، 300-500 ميليلتر). ضع القنينة [هبلك] إلى أوتوسامبلير من [هبلك] RP التحليلية.
    2. ضخ 250 ميليلتر لكل عينة. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في ميكن (الوينت ب). تنقية الببتيد استخدام تدرج من 10-40% الوينت ب أكثر من 30 دقيقة بمعدل تدفق 1.0 مل/دقيقة.
  2. TOF استخدام الطيف الكتلي
    ملاحظة: تأكيد هوية الببتيد باستخدام TOF (وقت الرحلة) الطيف الكتلي باستخدام حمض α-سيانو-4-هيدروكسيسيناميك كمصفوفة.
    1. نقل كمية مرئية من الببتيد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وتذوب في 10 ميليلتر 37 ملم α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك حمض الحل في خليط من 0.1% تفا ح2س/ميكن (1:1).
    2. دوامة الحل بالنسبة 10 s، تنطبق 2 ميليلتر من العينة مستهدفة أرض الصلب، وأيردري العينة.
    3. استخدام وضع عاكس للقياسات ومعايرة ببتيد قياسية للجماهير المولى أدناه 6000 غ/مول.
  3. Derivatization إيودواسيتاميدي
    ملاحظة: كما يتفاعل إيودواسيتاميدي مع جماعات ثيول، يشير إلى derivatization إيودواسيتاميدي من الببتيدات جماعات ثيول مجاناً. ومن ثم عدم وجود جماعات ثيول الحرة بمثابة عنصر تحكم رد فعل عن طريق مرض التصلب العصبي المتعدد خلال أكسدةش 1.
    1. حل الببتيد في العازلة الفوسفات 10 ملم (100 ميليلتر؛ الرقم الهيدروجيني 7.8 0.05 مم) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إضافة 100 ميليلتر من إيودواسيتاميدي في المخزن المؤقت للفوسفات 10 ملم (4 مم) إلى الحل الببتيد وهزه بلطف رد فعل ح 2 في درجة حرارة الغرفة في الظلام. فريزيدري الخليط رد فعل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    2. استخدام تلميح ماصة C18-تركيز عامل تصفية وشرط التلميح مع 10 ميليلتر من 80% (3 مرات)، 50% (3 مرات)، 30% (3 مرات) و 0% ميكن (3 مرات) في ح2س (+ 0.1% تفا).
    3. حل العينة من الخطوة 6.3.1 في 1 ميليلتر من 0.1% تفا ح2س وإضافة الحل إلى الفلتر ماصة. "الماصة؛" بعناية صعودا وهبوطاً حتى أن الببتيد بربط حبة. إزالة ح2س من طرف الماصة وشطف الفلتر ماصة مع 10 ميليلتر من 0.1% تفا ح2o.
    4. إضافة 2 ميليلتر من 0.1% تفا ح2س/ميكن (1:1) مع آخر نصيحة ماصة (بدون تصفية) على رأس حبة الذي يحتوي على الببتيد. تطبيق فيلتراتي إلى الهدف الأرضي الصلب وأيردري العينة.
    5. تطبيق 1 ميليلتر من حل حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك 37 ملم في خليط من 0.1% تفا ح2س/ميكن (1:1) إلى أرض الواقع الصلب المستهدفة مع العينة وأيردري العينة.
    6. استخدام وضع عاكس للقياسات ومعايرة ببتيد قياسية للجماهير المولى أدناه 6000 غ/مول.
  4. تحليل الأحماض الأمينية
    ملاحظة: تحليل تركيز الببتيد الدقيق، فضلا عن تكوين الببتيد استخدام محلل الأحماض الأمينية الأحماض الأمينية.
    1. نقل 100 ميكروغرام من الببتيد النقي (2604 g/mol؛ 0.04 µmol) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل ويحل المسحوق في 200 ميليلتر من 6 M HCl.
    2. نقل 200 ميليلتر من الحل في امبول زجاج وشطف الأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مرتين مع 200 ميليلتر من 6 M HCl. نقل الحل الشطف في امبول زجاج كذلك.
    3. أغلق امبول بتدفئة رقبة امبول مع لهب موقد بنسن. وضع امبول أنبوب زجاج. ضعه في كتلة تدفئة عن 24 ساعة عند 110 درجة مئوية للتحلل المائي.
    4. فتح في امبول ونقل الحل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل. أغسل امبول (3 × 200 ميليلتر) والحد الأقصى (3 × 100 ميليلتر) مع المقطر مزدوجة ح2س وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    5. الطرد المركزي هي الحل ح 6 في 60 درجة مئوية و 210 x g في مركز فراغ تناوب. حل المنتج طحين في 192 ميليلتر من المخزن المؤقت تمييع عينة (200 ميكرومتر) ونقل الحل إلى عامل تصفية الصغير-الطرد مركزي.
    6. الطرد المركزي العينة لمدة 1 دقيقة على 2300 × ميليلتر 100 ز ونقل فيلتراتي إلى أنبوب عينة تحليل الأحماض الأمينية. ضع الأنبوب إلى محلل الأحماض الأمينية والبدء في التحليل. يتم استخدام معيار الأحماض الأمينية للمعايرة.

7-MS/MS تحليل اتصال ثنائي كبريتيد

  1. الحد والالكله جزئية17
    1. حل 600 مكغ من الببتيد النقي (2604 g/mol؛ 0.23 µmol) في 1.2 مل من المخزن المؤقت لسترات 0.05 متر مكعب (درجة الحموضة 3.0؛ تركيز الببتيد 0.14 ملم) الذي يحتوي على 7.5 ملغ من tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب؛ م 0.02 0.03 مليمول).
    2. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة واتخاذ رد فعل عدة عينات ضبط (100 ميليلتر) تتراوح من 0 دقيقة إلى 30 دقيقة.
    3. خلط العينات في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت الألكلة (0.5 M تريس-خلات؛ ودرجة الحموضة 8.0؛ 2 مم الإيثيلين حمض (يدتا)؛ إيودواسيتاميدي م 1.1) التوقف عن رد فعل وأداء كارباميدوميثيليشن جماعات ثيول مجاناً.
    4. وقف رد الفعل بعد 5 دقائق عن طريق إضافة 100 ميليلتر من 10% تفا (في ح2س) وتخزين العينات في الثلج الجاف. إعداد عينات [هبلك] كما هو موضح في الخطوة 6.1.2 وحقن 400 ميليلتر. (الشكل 2أ)
    5. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في ميكن (الوينت ب). تحليل الببتيدات استخدام المزيج من فصل isocratic (10% الوينت ب لمدة 15 دقيقة) وثم تدرج بعد ذلك من 10-35% الوينت ب أكثر من 25 دقيقة بمعدل تدفق من 10 مل/دقيقة كشف قمم 220 نانومتر.
    6. جمع الكسور في أنابيب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي وفريزيدري الببتيدات. (الشكل 2ب)
    7. نقل كمية صغيرة من كل جزء في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لتحليل MS/MS من أشكال المؤكسدة (الاستمرار في الخطوة 7.1.12).
    8. حل الببتيد المتبقية (10-100 ميكروغرام) في 0.1% تفا ح2س (10-50 ميليلتر) وإضافة وحدة تخزين مناسبة لحل تسيب 100 ملم (في ح2س) للحصول على تركيز تسيب نهائي من 10 ملم.
    9. تبني رد فعل ح 1 في 37 درجة مئوية (الشكل 2-ج). فريزيدري الخليط رد فعل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    10. إعداد عينات MS/MS كما هو موضح في الخطوة 6.3.2-6.3.5.
    11. إجراء القياسات MS/MS على مطياف كتلة استخدام TOF/TOF. استخدام "غطاء" MS/MS (تسوس المستحثة بالليزر) لتجزئة الببتيد وتحديد الجماهير السلائف من 2-4 مرات والأنواع كارباميدوميثيلاتيد. معالجة وتقييم البيانات استخدام لتأكيد اتصال ثنائي كبريتيد المرجوة.

8-الرنين المغناطيسي النووي تجارب وتحليل هيكل

  1. حل حوالي 0.3-2 مغ من المنتج الببتيد نقية في 500 ميليلتر من ح2الباب2س (90:10) ونقل الخليط إلى microtube الرنين المغناطيسي.
  2. تحضير العينة للقياسات في مطياف الرنين المغناطيسي النووي
  3. سجل ثنائي الأبعاد [1ح،1ح]-دقف-مريح (ضعف الكم تصفية ارتباط مطيافية)، [1ح،1ح]-توكسي (مطيافية يرتبط مجموع)، [1ح،1ح]-نويسي (تعزيز أوفرهوزر النووية مطيافية)، و [1ح،13ج]-أطياف هسقك (هيتيرونوكلير تماسك الكم واحد) باستخدام قمع المياه.
  4. تعيين الأصداء بروتون من أطياف مسجل وإنشاء التعيين ذرة من الأطياف نويسي. مقارنة الكثافة في أطياف نويسي لتعيين قيود الحد الأعلى المسافة بين الذرات المختلفة في الببتيد. استخدام كثافة البروتونات جيرمنال لمعايرة كثافة الذروة.
  5. أداء حساب الهيكل وصقل مع برنامج كمبيوتر لتصور الجزيئية واستخدام connectivities ثنائي كبريتيد التي تم تحديدها في الخطوة 7 كقيود إضافية (الشكل 3).
  6. حدد الهياكل مع أدنى الطاقات واستخدامها لمحاكاة ديناميات الجزيئية (MD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

15 مختلفة سد ثنائي كبريتيد ايزومرات بييا μ-كونوتوكسين توليفها وتتميز بالتفصيل (الشكل 1). يتم تعريف السندات ثنائي كبريتيد بالحد الجزئي والتحليل اللاحق MS/MS (الشكل 2). يتم إجراء تحليل الرنين المغناطيسي ايزومرات مختلفة (الشكل 3) للكشف عن هياكل الببتيد الفردية. جدير بالذكر أن مزيجاً من البرنامج العادي [هبلك] وتجزئة MS/MS وتحليل الرنين المغناطيسي النووي مطلوب للتعريف الواضح لاتصال ثنائي كبريتيد.

Figure 1
الشكل 1 : ثنائي كبريتيد انتقائية تشكيل السندات بيييا μ الأصلي عن طريق استراتيجية مجموعة حماية. (أ) deprotection سيستينيس حزب تاي راك تاي المحمية أثناء الانقسام الببتيد من الراتنج. (ب) سد ثنائي كبريتيد أول تشكيل سيستينيس غير المحمية. (ج) Deprotection وتشكيل جسر ثنائي كبريتيد الأسبستوس محمية سيستينيس. (د) حماية Deprotection وتشكيل جسر ثنائي كبريتيد تيبو سيستينيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : سير عمل تخفيض جزئي للتعيين بوند ثنائي كبريتيد "تحليل" MS/MS. (أ) الحد الجزئي والالكله الببتيد. (ب) تنقية [هبلك] لعينات مراقبة ردود فعل مختلفة. (ج) الحد العينات النقية. جزئيا هاربر كارباميدوميثيلاتيد الأنواع (الببتيدات اثنين في الوسط) معلومات عن اتصال ثنائي كبريتيد الذي يحدده تحليل MS/MS. وهذا الرقم قد تم تكييفه مع إذن من هيمير, P. et al. كونوتوكسين μ conformational ايزومرات بيييا إعادة النظر: أثر سيستين الأقران على انتداب ثنائي كبريتيد-السندات وتوضيح الهيكل. الكيمياء التحليلية. 90 (5)، 3321-3327 (2018). حقوق التأليف والنشر (2018) جمعية الكيميائيين الأمريكية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : السير متسلسلة وهيكل الحل الرنين المغناطيسي الناتجة جامدة (يسار) وايزومير μ (يمين) مرنة-بيييا. تظهر هياكل 20 مع طاقات أدنى، فضلا عن اتصال ثنائي كبريتيد ايزومرات مختلفة. مقارنة قيم جذر متوسط مربع الانحراف (رمسد) يوضح أن ببتيد جامدة معظمها يؤدي إلى تحسين هيكل الرنين المغناطيسي حلها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموضحة هنا لتركيب الببتيدات سيستين الغنية مثل بيييا μ يمثل إمكانية لإنتاج ايزومرات ثنائي كبريتيد المستعبدين من نفس تسلسل الأحماض الأمينية بشكل انتقائي. ولذلك، أنشأت أساليب مثل الصلبة المستندة إلى معتدلاً المرحلة الببتيد التوليف18 واستراتيجية مجموعة حماية محددة لتشكيل روابط ثنائي كبريتيد ريجيوسيليكتيفي كانت تستخدم16. يمكن أن تنتج توليف المرحلة الصلبة الببتيد تسلسل الأحماض الأمينية على دعم بوليمر (راتنج) عن طريق التجميع الآلي. هذه الأحماض الأمينية محميون من التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها أثناء تسلسل الجمعية بمجموعات حماية خاصة في سلاسل جانبية، و-حسب البروتوكول المستخدم--ديبروتيكتيد عند الانقسام الببتيد من الراتنج. هذه الحماية ينطبق أيضا على سلاسل الجانب سيستين داخل سلسلة الببتيد، على سبيل المثال-، حماية ترتيل. حماية متميزة بيد مجموعات لأزواج الفردية من سيستينيس مثل أسيتاميدوميثيل و ثالثي-بوتيل هي لا المشقوق في الوقت ذاته من خلال هذه الخطوة القضاء. يمكن المشقوق هذه المجموعات حماية قبالة في ظل الظروف التي تسمح للأكسدة اللاحقة بتشكيل ثنائي كبريتيد السندات من جماعات ثيول ديبروتيكتيد. بهذه الطريقة، يمكن أن تكون جميع ايزومرات ثنائي كبريتيد 15 من الببتيد التي تحتوي على ستة سيستين المخلفات شكلت بشكل انتقائي7،16. ومع ذلك، هو العامل المقيد، مع عدد متزايد من مختلف مجموعات حماية متعامد الزيادات جهد الاصطناعية، الذي له تأثير عال على عائد الببتيد ثنائي كبريتيد المطلوب سدها. وهكذا، في حالات مختارة وخاصة لأقل معقدة الببتيدات حيازة سندات ثنائي كبريتيد واحد فقط أو اثنين الأكسدة ذاتية قابلة للطي الواقع قد يكون النهج المفضل على استراتيجية مجموعة حماية.

هنا، يتم إزالة مجموعات حزب تاي راك تاي لزوج واحد سيستين بفعل تفا بعد انتهاء الجمعية الببتيد ومعتدلا-deprotection النهائية للحمض الأميني الطرفي ن. الظروف الحمضية، ومع ذلك، ترك Acm و tبو حماية الجماعات في أزواج اثنين الأخرى من مخلفات سيستين سليمة. في وقت لاحق، تنقية الببتيد الخطي الذي يحتوي على اثنين من سيستينيس غير المحمية تتم باستخدام محضرة [هبلك] تحت الظروف الحمضية قليلاً للحفاظ على المجموعات ثيول الموجودة في النموذج البروتونية. ما زال البروتوكول مع أول خطوة الأكسدة بعد التحقق من تحليل [هبلك] ومرض التصلب العصبي المتعدد التحليلية التوليف الناجحة و deprotection من حزب تاي راك تاي في زوج سيستين من الفائدة. نفذت الخطوات الأخرى من deprotection والأكسدة السند ثنائي كبريتيد الثانية والثالثة وأكد بنفس الطريقة استخدام البروتوكول المناسب لمواد تحتوي على الأسبستوس و تيبو، على التوالي. هذه التفاعلات الأكسدة هي هكذا بسيطة الرطب-الكيميائية ردود فعل أداؤها في الحل التي لا تتطلب الكواشف باهظة الثمن. العيب، ومع ذلك، هو أن بعض ردود الفعل، أي. واتصالات بقايا سيستين متميزة، لا تقم بالمتابعة بشكل سلس وتماماً مما يؤدي إلى الآثار الجانبية لسارعت اتصال ثنائي كبريتيد. ما لم تتم إزالة هذه بعد انتهاء تفاعلات أكسدة الفردية، يمكن أن تتراكم هذه المنتجات في مزيج النفط الخام المنتج. وبعض هذه قد تمتلك الخصائص الفيزيائية الكيميائية مماثلة الببتيد الفعلي، على سبيل المثال-، شطف [هبلك]، مما يزيد من الجهد لتنقية الببتيد مطوية بشكل صحيح. على الرغم من التوليف وتنقية يمكن أن تكون صعبة، كما الحال بالنسبة μ-بييا، هذا الأسلوب يمكن استخدامها بنجاح، ولكن يتطلب مهارات جيدة في دليل والمراقبة. أخيرا، من الضروري اعتبار أن كل تسلسل الببتيد مختلفة وذلك قد تكون معاملة مختلفة لكي تكون ناجحة في توليد القدرة على الاتصال الصحيح ثنائي كبريتيد.

بالإضافة إلى توليف الصعبة، من الضروري للتحقق من ما إذا كانت السندات ثنائي كبريتيد أنتجت صحيحة، أي.، تمثل الإصدار المقصود من ايزومير ثنائي كبريتيد كل منهما. وهذا يتم هنا باستخدام مزيج من تحليل استخدام MS/MS وتوضيح هيكل الرنين المغناطيسي النووي. يتم إجراء تحليل MS/MS باستخدام مختلف المشتقات جزئيا انخفاض ويؤلكل (كارباميدوميثيليشن) من الببتيد تماما المؤكسد17. باستخدام MS/MS "غطاء" TOF/TOF وجدت الأطياف عدد زوجي من سيستينيس كارباميدوميثيلاتيد دائماً، أي، كارباميدوميثيلاتيد 2 أو 4 أو 6 مرات. وهذا يمكن تفسيره بالتخفيض التدريجي من الببتيدات المؤكسد تماما، منذ في كل مناسبة دائماً يتم تخفيض وظيفتين ثيول كل السندات ثنائي كبريتيد (فتح) و في الموقع يؤلكل باستخدام إيودواسيتاميدي. هذا كارباميدوميثيليشن من سيستينيس اثنين كل يمكن الكشف عن باستخدام MS/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف، وفي المقابل، يشير إلى سند كل منهما ثنائي كبريتيد تخوض هذه سيستينيس في الببتيد سليمة. على سبيل المثال، حدوث أربع سيستينيس كارباميدوميثيلاتيد في تسلسل مع ثنائي كبريتيد ثلاثة سندات يساعد على تحديد واحدة شكلت السندات محددة، هي واحدة بين سيستينيس غير يؤلكل اثنين، التي فتحت لا أثناء وقت رد الفعل سندات تخفيض جزئي كافية لفتح اثنين آخرين. وهكذا، يمكن connectivities ثنائي كبريتيد بتحليل استخدام MS/MS لمشتقات كارباميدوميثيلاتيد 2-4 مرات ومختلف الايزومرات ثنائي كبريتيد الببتيد، أوضحت تماما والمؤكدة.

إمكانية أخرى لإلقاء الضوء على نمط بوند ثنائي كبريتيد هو تحليل MS/MS انزيماتيكالي هضم الببتيدات، حيث الببتيد تكون بروتيوليتيكالي المشقوق في الأحماض الأمينية متميزة لإنتاج أجزاء أصغر. يمكن لا يزال ربط هذه الشظايا قصيرة عن طريق سندات ثنائي كبريتيد، الذي هو السبب في أنه يمكن توضيح نمط ثنائي كبريتيد من MS/MS تحليل هذه الأجزاء المرتبطة. في حالة μ-بيييا، ولكن هذه الاستراتيجية تعذر تطبيق لأن بعض سيستينيس في التسلسل المتاخمة مباشرة لبعضها البعض ولذلك لا تفصل هضم الببتيدات سيستينيس من بعضها البعض. ولذلك من الصعب تحديد الجسر ثنائي كبريتيد محددة.

يسر في توضيح هيكل 2D الرنين المغناطيسي تحليل الواضح في حالة اتصال ثنائي كبريتيد معروفة، نظراً لأن هذه المعرفة تتيح تعيين تأثير أوفرهوزر النووية (نوى) لمعين البروتونات، أي.، مشيراً إلى المكانية المسافة بين اثنين ذرات العزم من شدة الإشارات نويسي (تجربة الرنين المغناطيسي النووي عن طريق الفضاء). التحليل، ومع ذلك، يبدأ مع متسلسلة سيرا على الأقدام19 تطبق على الأطياف مريحة وتوكسي ونويسي، وبهذه الطريقة، فمن الممكن لتعيين إشارة محددة إلى ح-الذرة المقابلة من الأحماض الأمينية (نظام الدوران) في التسلسل. قيود المسافة المذكورة آنفا من التجربة نويسي المستخدمة في حساب هيكل الببتيد7. أكثر الإشارات المحددة، أكثر دقة وسوف يكون الهيكل. ومع ذلك، يزيد صعوبة هذه المهمة مع عدد الأحماض الأمينية في الببتيد، ومع حدوث سيستينيس المجاورة، كما يزيد الاحتمال أن إشارات عديدة الذرات تتداخل ويمكن لم تعد دقة تعيين الواجب لإغلاق قربها. وعلاوة على ذلك، مرونة سلسلة الببتيد حاسمة بالنسبة لما إذا كانت إشارات في الرنين المغناطيسي النووي يمكن تحديدها بسهولة أو صعوبة. أكثر مرونة منطقة ببتيد، تحدث التغييرات conformational أكثر، مما يتيح إشارات متعددة الحصول على ذرة واحدة. وهكذا يقلل الكثافة مع عدد والتشكلات، مما يسبب إشارات تختفي في ضجيج الخلفية. وهذا يعني أن توضيح هيكل ثلاثي الأبعاد عن طريق الرنين المغناطيسي يصبح أسهل بكثير إذا كانت مقيدة التسلسل كونفورماتيونالي.

وأخيراً، هذا البروتوكول يجعل من الممكن لتوليد متعددة الببتيدات سد ثنائي كبريتيد برصد تشكيل ثنائي كبريتيد السندات تحليل استخدام MS/MS وملازمة 2D الرنين المغناطيسي النووي بنية توضيح7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونود أن نشكر ريسمان ألف وواو ياء ماير سوكو دال من بروكر دالتونيكس GmbH بريمن؛ دال تيتزي، تيتزي ألف ألف، شميدتس ف وتييلي جيم من جامعة دارمشتات للتكنولوجيا؛ Ohlenschläger سين من يينا FLI، م. انجيسير من جامعة بون؛ كرامر ك. وألف هارزين H. ناكاجامي من معهد ماكس بلانك لبحوث تربية النبات، كولونيا؛ سوزان نوبيرت من معهد علم الحيوان، كولونيا؛ ومرافق التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي الجزيئية البيولوجية من جامعة فرانكفورت للتقنية الدعم والتدريب الوحدات النمطية، والوصول إلى الأدوات. هو العرفان بالدعم المالي المقدم من جامعة بون إلى D.I..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Tags

الكيمياء، العدد 140، الببتيدات، سيستين الغنية، ثنائي كبريتيد الربط، والتوليف، حماية استراتيجية الفريق، تحليل هيكل، 2D الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)، MS/MS (الترادف الطيف الكتلي)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for:Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
التوليف وتصميم هيكل الايزومرات بييا μ-كونوتوكسين مع Connectivities ثنائي كبريتيد مختلفة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, … More

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter