Aislamiento de CD4+ las células de T y análisis de circulación folicular T Helper (cTfh) subconjuntos de la célula del uso de sangre periférica citometría de flujo de 6 colores

Summary

Aquí, un protocolo para el aislamiento y la caracterización de CD4⁺ T-cell se describe subconjuntos de sangre periférica humana. Purificada de CD4⁺ las células T son analizadas por citometría de flujo para determinar proporciones de subconjuntos de células helper T-folicular.

Abstract

Actividad folicular T aberrante de las células helper (Tfh) es detectable en condiciones autoinmunes y su presencia se asocia con resultados clínicos cuando se analiza el microambiente del nodo de linfa en el linfoma no Hodgkin de células B. Subconjuntos de linfocitos T-folicular (cTfh), el compartimiento de memoria circulantes de Tfh células en la sangre en circulación son también perturbados en la enfermedad y por lo tanto representan potenciales nuevos biomarcadores predictivos. Pruebas basadas en sangre periférica es ventajoso porque es relativamente no invasivo y permite el control serial simple. Este artículo describe un método para aislar CD4⁺ las células T de sangre humana y posterior análisis mediante citometría de flujo para enumerar las células cTfh y las proporciones de sus diferentes subconjuntos (cTfhPD-1^{-/ + / hi}, cTfh1, 2, 17 y cTfh1/17). El nivel de estos subconjuntos se comparó entonces entre sujetos normales y pacientes con linfoma. Encontramos que el método era suficientemente robusto como para obtener resultados confiables de material paciente habitualmente recogido. La técnica que describimos para el análisis es adaptable fácilmente a célula clasificación y aplicaciones posteriores como RT-PCR.

Introduction

Linfocitos T folicular (Tfh) son un CD4⁺ subconjunto de células T que fue inicialmente caracterizada en tejidos linfoides¹. Estas células expresan PD-1 y receptores de superficie de CXCR5, secretan IL-21 e IL-4 y expresión nuclear del factor de transcripción, BCL-6^2,3. Como su nombre lo indica, se encuentran en centros germinales y son esenciales para la producción de anticuerpos de alta afinidad¹.

Respuestas de Dysregulated Tfh se han implicado en la patogénesis de la enfermedad, especialmente enfermedades autoinmunes, donde promueven la expansión de las células autorreactivas B⁴. También desempeñan un papel en el microambiente del tumor sólido^5,6 y⁷de cánceres linfoides. Por el contrario, defectos genéticos de proteínas de la superficie esenciales para ESF funcionan como resultado de costimulator (ICOS) de células T inducible en síndromes de inmunodeficiencia humana⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ células en sangre periférica se denominan circulantes linfocitos T folicular (cTfh) y se cree que el compartimiento de memoria de Tfh células en los tejidos⁹. El propósito del método descrito aquí es el análisis de subconjuntos de cTfh siguiendo CD4⁺ aislamiento de muestras de sangre periférica de la célula.

Se han definido varios subconjuntos de cTfh y la eficiencia con la que proporcionan ayuda de la célula de B difiere de un subconjunto a otro^9,10,11,12. Las proporciones relativas de estos subconjuntos se alteran en un número de enfermedades, la mayoría prominente trastorno autoinmunitario en el que hay es casi siempre un aumento relativo en el PD-1 más funcional^{+ Hola} o cTfh2 o cTfh17 los subconjuntos en comparación con los menos PD-1 funcional^– o cTfh1 subconjuntos¹². La magnitud de estos cambios con frecuencia asociado con parámetros clínicos incluyendo títulos de actividad y autoanticuerpo enfermedad, indicando un papel potencial de la distribución de cTfh subconjunto como un biomarcador pronóstico en la enfermedad, que puede reflejar la actividad de ESF en tejidos linfoides^9,12,13,14. Además, tomando muestras de sangre de los participantes es rápida, segura y aceptable y así permite serie de monitoreo para el análisis de progresión de la enfermedad o respuesta a la terapia.

El uso de aislado CD4⁺ las células T sobre suspensiones de células mononucleares (MPC) de sangre periférica tradicional permite experimentos de citometría de flujo de rendimiento más altos, reduciendo el tiempo necesario para adquirir un número considerable de cTfh células para análisis. Esto es particularmente útil cuando clasificación células de cTfh rara subconjuntos utilizando flujo activada (FACS) de clasificación de la célula. Para ayudar a la eficacia, estas suspensiones pueden ser criopreservadas para habilitar la “dosificación” de muestras a utilizar en el experimento de citometría de flujo. En la prueba, el CD4⁺ pureza no se redujo por criopreservación.

Mientras que diferentes laboratorios utilizados diferentes marcadores para categorizar cTfh células en las primeras etapas de su descubrimiento, el método presentaron aquí hace uso de un esquema Unificado de dos grupos de marcadores de superficie celular propuesto por Schmidt et al.^{12, 15} para permitir la identificación simultánea de cTfh y sus subconjuntos reconocidos nueve en una citometría de flujo único experimento.

Como son sólo marcadores de superficie celular, las células no requieren fijación o permeabilización y así pueden permanecer vivas para posteriores estudios funcionales. Esto podría facilitarse mediante clasificación utilizando FACS con el mismo panel de anticuerpos de la célula. Este panel podría ampliarse para incluir otros marcadores, teniendo en cuenta las restricciones del citómetro de flujo se utiliza.

El análisis de experimentos de citometría de flujo de varios colores puede ser difícil debido a la naturaleza inherentemente subjetiva de gating en punto 2 dimensiones de parcelas, sobre todo cuando poblaciones celulares no tienen una distribución bimodal clara en fluorescencia del marcador, como es el caso de las células de la cTfh y sus subconjuntos. Por esta razón, es imprescindible establecer controles efectivos para reducir los artefactos para permitir una mejor resolución de las poblaciones y establecer estrategias que bloquean con confianza. Como tal, diseño del panel de anticuerpos y la puesta en marcha de controles básicos para un flujo cytometry experimentan, es decir, mediante indemnización y FMO controles se detallan en el paso 3.4.2 y 3.4.3,respectively.

Todas las células de la cTfh se definen como CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. El nivel de expresión del marcador característico de activación de Tfh PD-1 se puede determinar entonces identificar los subconjuntos de PD-1^–,⁺ de PD-1 o PD-1^Hola cTfh células. Luego, usando una combinación de los receptores del chemokine CXCR3 y CCR6, que se expresan diferencialmente por Th1 tradicionales 2 o 17 células, cTfh se puede caracterizar como cTfh1, 2 o 17-como por un perfil de CXCR3⁺ CCR6^–, CXCR3^– CCR6^– y CXCR3^– CCR6⁺, respectivamente.

El panel de anticuerpos utilizado en nuestro laboratorio se muestra en la tabla 1. El usuario tenga que adaptar su selección fluoróforo para tener en cuenta el láser y la configuración de filtros de luz disponible en su citómetro de flujo local.

Las siguientes consideraciones influyen en la elección de fluoróforos. Uso de fluoróforos brillante posible. En particular, utilice los fluoróforos más brillantes disponibles en los marcadores más tenue (menos altamente expresados). Marcadores de dimmer incluyen PD-1, CXCR3 y CCR6 y en menor medida, CXCR5. Específicamente hizo uso de la nueva BB, BV y BUV fluoróforos que brindan excelente luminosidad y permitan así una más fácil resolución de poblaciones distintas de las células.

Extender la selección fluoróforo a través de los espectros de emisión tanto como sea posibles reducir al mínimo solapamiento espectral y así el nivel de compensación requerido. Una herramienta gratis, en línea que puede utilizar para ayudar a diseñar un panel de citometría de flujo se puede encontrar aquí: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Para ahorrar espacio en el espectro de emisión, se empleó un “canal de descarga” usando un tinte de viabilidad con una longitud de onda de emisión que se superpone con la de APC-H7 (CD45RA conjugado) para permitir la detección y exclusión de ambos muertos o CD45RA⁺ con un solo detector.

Aquí, se presenta un protocolo para el aislamiento de la sangre periférica CD4⁺ las células T y su posterior análisis mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de la diferentes y recientemente descrito circulación subconjuntos.

Protocol

Se obtuvieron muestras de sangre de sujetos normales (NS) (n = 12) así como pacientes con linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) y otros tipos de linfoma no Hodgkin de células B (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma lymphoplasmacytic y 1 bajo grado de células B no especificado linfoma del no Hodgkin paciente). Se reclutaron pacientes de las clínicas de Hematología en el Royal Infirmary de Leicester después de haber informado, consentimiento por escrito, con la aprobación ética en lugar de todos los estud…

Representative Results

Alta CD4+ pureza fue alcanzada usando el CD4+ protocolo de aislamiento, que era confiable a través de todas las muestras de sangre probados por nosotros (significa: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (figura 3). Identificación de cTfh (CD4+ CXCR5+ células) en un sujeto normal representativo se presenta (figura 4A). L…

Discussion

Este protocolo representa una manera simple y eficaz para analizar las células de cTfh de sangre periférica, lo que permite la detección de todos los subconjuntos relevantes identificados en la literatura hasta el momento. Muestras de sangre pueden fácilmente y eficientemente obtenerse como parte de estándar pacientes clínicas y muestras seriales se puede recoger en paralelo con los datos clínicos. A su vez, esto permite estudios prospectivos evaluando la cTfh subconjuntos como biomarcadores de progresión de la e…

Materials

RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973