用两相循环流系统实时成像和定量真菌生物膜的研究
Summary
介绍了一种在水流下实时成像真菌生物膜形成的流动装置的组装、操作和清洗。我们还提供并讨论了用于获取图像的定量算法。
Abstract
在口咽念珠菌病中,念珠菌属的成员必须坚持和生长在口腔粘膜表面, 而在唾液流动的影响下。虽然在流的增长模型已经开发, 许多这些系统是昂贵的, 或不允许成像, 而细胞在流动。我们开发了一种新的仪器, 使我们能够想象在流动和实时的白色念珠菌细胞的生长和发展。在这里, 我们详细介绍了该流程设备的组装和使用的协议, 以及所生成数据的量化。我们能够量化单元格附加到和从幻灯片中分离的速率, 以及确定随时间推移的幻灯片上生物量的测量值。该系统既经济又多功能, 与许多类型的光学显微镜, 包括廉价的台式显微镜, 并能延长成像时间相比, 其他流系统。总的来说, 这是一个低吞吐量的系统, 可以提供非常详细的实时信息的生物膜生长的真菌物种在流动。
Introduction
白色念珠菌(C. 白念珠菌) 是人类的一种机会性真菌病原体, 可感染多种组织类型, 包括口腔粘膜表面, 导致口咽念珠菌病, 并导致受影响的个人的生活质量降低1。生物膜的形成是影响白念珠菌发病的重要特征, 对白念珠菌生物膜的形成和功能进行了大量的研究2,3,4, 5, 其中许多已使用静态 (无流)体外模型进行。然而, 白念珠菌必须坚持和生长在唾液流在口腔中存在。许多流动系统已经开发, 以允许活细胞成像6,7,8,9,10。这些不同的流系统是为不同的目的而设计的, 因此每个系统都有不同的优点和缺点。我们发现, 许多适合C. 白念珠菌的流动系统成本高昂, 需要复杂的制造部件, 或者在流动过程中无法成像, 必须在成像之前停止。因此, 我们开发了一种新的流动装置来研究11流动下的白念珠菌生物膜形成。在我们的流量仪设计过程中, 我们遵循了这些主要考虑因素。首先, 我们希望能够实时量化生物膜生长和发展的多个方面, 而无需使用荧光细胞 (允许我们轻松研究突变菌株和未修改的临床分离株)。其次, 我们希望所有部件都能在商业上提供, 几乎没有任何修改 (i. e., 没有定制制造), 允许其他人更容易地重新创建我们的系统, 并允许轻松维修。第三, 我们还希望允许在相当高的流速率下延长成像时间。最后 , 我们希望 , 经过一段时间的细胞附着到基质动 , 能够监测生物膜生长在较长的时间 , 而不引入新的细胞。
这些考虑促使我们开发了图 1所示的双瓶循环流系统。两个烧瓶允许我们将实验分为两个阶段, 一个附着阶段, 从细胞种子附着烧瓶中吸取, 以及使用无细胞培养基继续生物膜生长的生长阶段, 而无需添加新细胞。该系统设计用于显微镜的孵育室, 其前面的滑块和油管 (2 到 5,图 1) 放置在孵化器内, 而所有其他组件放置在一个大型辅助容器外显微镜。此外, 带有附加温度探针的电炉搅拌器用于保持附着烧瓶中的真菌细胞37摄氏度。由于它是循环的, 这个系统能够连续成像在流动期间 (可以超过36小时取决于条件), 并可用于大多数标准显微镜, 包括直立或倒置台式显微镜。在这里, 我们讨论了流量设备的组装、操作和清洗, 并提供了一些基本的 ImageJ 定量算法来分析实验后的视频。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用上述流程系统, 可以生成真菌生物膜生长和发育的定量延时视频。为了使实验进行比较, 必须确保成像参数保持不变, 这一点至关重要。这包括确保为每个实验设置科勒照明的显微镜 (许多参考线可在线进行此过程)。除了成像参数, 在使用流设备时还要牢记一些重要步骤。首先, 确保气泡疏水阀在流体流动过程中保持真空, 这一点很重要, 因为如果不这样做, 将导致空气通过气泡疏水阀被拉入。同…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想承认韦德博士 Sigurdson 在设计流动装置方面提供了宝贵的投入。
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
Riferimenti
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