Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow
Summary
Beschreiben wir die Montage, Betrieb, und Reinigung von einem Fluss Apparat Bild Pilz Biofilmbildung in Echtzeit unter fließen sollen. Wir bieten und diskutieren quantitative Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder verwendet werden.
Abstract
Im oropharyngealen Candidose müssen Mitglieder der Gattung Candida halten und wachsen auf der mündlichen Schleimhautoberfläche während unter dem Einfluss von Speichel fließen. Während Modelle für das Wachstum unter Strömung entwickelt wurden, viele dieser Systeme sind teuer oder nicht zulassen, imaging, während die Zellen unter Strom stehen. Wir haben ein neuartiges Gerät entwickelt, das uns erlaubt, das Wachstum und die Entwicklung von Candida Albicans Zellen durch fließen und in Echtzeit-Bild. Hier zeigen wir das Protokoll für die Montage und Nutzung von dieser Strömung Apparat sowie die Quantifizierung der Daten, die generiert werden. Wir sind in der Lage, die Preise zu quantifizieren, die die Zellen zum Anfügen und trennen von Folie, sowie ein Maß für die Biomasse auf der Folie im Laufe der Zeit zu bestimmen. Dieses System ist wirtschaftlich und vielseitig, mit vielen Arten von Lichtmikroskopen, einschließlich preiswerte Benchtop Mikroskopen arbeiten und ist in der Lage, erweitert imaging Zeiten im Vergleich zu anderen wasserführenden Systemen. Insgesamt ist dies ein niedriger Durchsatz-System, die sehr detaillierte Echtzeit-Informationen auf das Wachstum von Biofilm Pilzarten unter Strom liefern kann.
Introduction
Candida albicans (C. Albicans) ist eine opportunistische pilzliche Erreger von Menschen, die viele Gewebetypen, einschließlich mündliche Schleimhaut-Oberflächen, wodurch oropharyngealen Candidose und daraus resultierende in eine geringere Lebensqualität für die betroffenen Personen1infizieren können. Biofilmbildung ist ein wichtiges Merkmal für die Pathogenese von C. Albicans, und zahlreiche Studien haben auf die Bildung und Funktion von C. Albicans Biofilme2,3,4getan wurde, 5, viele davon wurden durchgeführt mit statisch (keine Strömung) in-vitro- Modelle. Allerdings müssen C. Albicans halten und wachsen in Gegenwart von Speichel fließen in die Mundhöhle. Zahlreiche Flow-Systeme wurden entwickelt, um für live Cell imaging6,7,8,9,10ermöglichen. Diese verschiedenen Flow-Anlagen sind für verschiedene Zwecke konzipiert und daher jedes System hat unterschiedliche Stärken und Schwächen. Wir fanden, dass viele der Strömung, die Systeme für C. Albicans angemessen waren kostspielig, erforderliche Anlage fabriziert Teile, oder könnte nicht abgebildet im Fluss und vor Bildgebung gestoppt werden musste. Daher entwickelten wir eine neuartige Strömung Apparat um C. Albicans Biofilmbildung unter Fluss11zu studieren. Bei der Konzeption unserer Flow-Apparate folgten wir dieser wichtigen Überlegungen. Erstens wollten wir mehrere Aspekte der Biofilm Wachstum und Entwicklung in quantifizieren zu können ohne die Verwendung von fluoreszierenden Zellen (so dass uns Studie mutierte Stämme und unveränderten klinischen Isolaten leicht) in Echtzeit. Zweitens wollten wir alle Teile mit wenig bis keine Änderungen im Handel erhältlich sein (zB., keine eigene Fertigung), andere mehr einfach unser System neu und für einfache Reparaturen. Drittens: Wir wollten auch ermöglichen längere Zeiten bei relativ hohen Flussraten imaging. Schließlich wollten wir, nach einer Phase der Zellen, die Befestigung auf dem Untergrund durch fließen, der Biofilm-Wachstum über einen längeren Zeitraum ohne Einführung neue Zellen überwachen zu können.
Diese Überlegungen führten uns zu zwei Kolben rezirkulierenden Flow-System in Abbildung 1dargestellt. Die zwei Kolben ermöglichen es uns, das Experiment in zwei Phasen, eine Anlage-Phase, die aus der Zelle ausgesät Anlage Flasche zieht und eine Wachstumsphase, die zellfreien Medien nutzt, um den Biofilm wachsen ohne den Zusatz von neuen Zellen aufgeteilt. Dieses System dient zur Arbeit mit einer Inkubation Kammer für das Mikroskop mit der Folie und der Schlauch davor (2 bis 5, Abbildung 1) in die brutmaschine gelegt und alle anderen Komponenten in einem großen sekundären Behälter außerhalb der Mikroskop. Darüber hinaus eine Herdplatte Rührer mit einem angeschlossenen Temperaturfühler verwendet wird, um Pilzzellen in der Anlage Kolben bei 37 ° c zu halten Wie es Rezirkulation ist, dieses System ist in der Lage, kontinuierliche Bildgebung während Flow (kann über 36 h je nach Bedingungen), und auf die gängigen Mikroskope, einschließlich aufrecht oder invertierte Benchtop Mikroskopen verwendet werden kann. Hier diskutieren wir die Montage, Betrieb, und Reinigung des Apparates fließen, sowie als bieten einige grundlegende ImageJ quantitativen Algorithmen, die Videos nach einem Experiment zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit Hilfe der Flow-System ermöglicht wie oben beschrieben für die Generation der quantitativen Zeitraffer-Videos von Pilz Biofilm Wachstum und Entwicklung. Um Vergleiche zwischen Experimente zu ermöglichen ist es von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die bildgebenden Parameter gleich gehalten werden. Dazu gehört, dass das Mikroskop für Köhler Beleuchtung für jedes Experiment eingerichtet ist, (viele Guides sind online verfügbar für diesen Prozess). Abgesehen von imaging-Parameter, gibt es einige…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Wade Sigurdson bestätigen für die Bereitstellung von wertvollen Beitrag bei der Gestaltung des Apparates fließen.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
Riferimenti
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