Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico
Summary
Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.
Abstract
En la candidiasis orofaríngea, miembros del género Candida deben cumplir y crecen en la superficie de la mucosa oral mientras que bajo los efectos del flujo salival. Mientras que se han desarrollado modelos para el crecimiento bajo flujo, muchos de estos sistemas son caros, o no permiten la proyección de imagen mientras que las células están bajo flujo. Hemos desarrollado un novedoso aparato que permite el crecimiento y desarrollo de las células de la Candida albicans bajo flujo y en tiempo real de la imagen. Aquí detallamos el protocolo para el montaje y el uso de este aparato de flujo, así como la cuantificación de los datos que se generan. Somos capaces de cuantificar los tipos de las células a y separan de la diapositiva, así como determinar una medida de la biomasa en la diapositiva con el tiempo. Este sistema es económico y versátil, trabajando con muchos tipos de microscopios ópticos, como microscopios de mesa barato, y es capaz de extendido veces en comparación con otros sistemas de flujo de imágenes. En general, se trata de un sistema de bajo rendimiento que puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre el crecimiento de biofilm de especies fúngicas bajo flujo.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) es un patógeno fúngico oportunista de seres humanos que pueden infectar a muchos tipos de tejido, incluyendo superficies de la mucosa orales, provocando candidiasis orofaríngea y resultando en una menor calidad de vida para los individuos afectados1. Formación de biofilms es una característica importante para la patogenia de la C. albicans, y se han realizado numerosos estudios sobre la formación y la función de C. albicans biofilms2,3,4, 5, muchos de los cuales se realizan en estática (sin flujo) en vitro modelos. Sin embargo, C. albicans debe adherirse y crecer en presencia de flujo salival en la cavidad bucal. Han desarrollado numerosos sistemas para permitir que células vivas imágenes6,7,8,9,10. Estos diferentes sistemas han sido diseñados para diferentes propósitos, y por lo tanto cada sistema tiene diferentes fortalezas y debilidades. Hemos encontrado que muchos del flujo de los sistemas apropiados para C. albicans eran costosos, complejo requiere fabricación de partes, o no podía ser había reflejada durante el flujo y tuvo que ser parado antes de la proyección de imagen. Por lo tanto, hemos desarrollado un aparato de flujo novela para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans bajo flujo11. Durante el diseño de nuestro aparato de flujo, seguimos estas consideraciones principales. En primer lugar, queríamos ser capaces de cuantificar varios aspectos del crecimiento del biofilm y desarrollo en tiempo real sin requerir el uso de células fluorescentes (permitiéndonos estudio cepas mutantes y aislados clínicos sin modificar fácilmente). En segundo lugar, queríamos que todas las partes a ser comercialmente disponibles con poca o ninguna modificación (es decir., no hay fabricación de encargo), permitiendo que otros más fácilmente recrean nuestro sistema y permitir fácil reparación. En tercer lugar, también hemos querido permitir extendido veces a velocidades de flujo razonablemente alta de imagen. Por último, hemos querido, después de un período de fijación para el sustrato bajo flujo, de células para controlar el crecimiento de biofilm en un período de tiempo sin la introducción de nuevas células.
Estas consideraciones nos llevaron a desarrollar el sistema de flujo recirculación dos frasco, ilustrado en la figura 1. Los dos matraces nos permiten dividir el experimento en dos fases, una fase de apego que extrae del frasco de semillas celular accesorio y una fase de crecimiento que utiliza los medios libres de células para continuar el crecimiento de biopelícula sin la adición de nuevas células. Este sistema está diseñado para trabajar con una cámara de incubación para el microscopio, con la corredera y el tubo anterior (de 2 a 5, figura 1) se coloca dentro de la incubadora, y todos los componentes colocan en un contenedor secundario grande fuera de la microscopio. Además, se utiliza un agitador de placa calefactora con un sensor de temperatura conectado para mantener células fúngicas en el matraz de accesorio a 37 ° C. Mientras está recirculando, este sistema es capaz de la proyección de imagen continua durante el flujo (puede ser más de 36 horas dependiendo de las condiciones) y puede utilizarse en la mayoría de los microscopios, incluyendo microscopios de mesa vertical o invertido. Aquí discutimos el montaje, operación, y la limpieza de los aparatos de flujo, así como proporcionar algunos algoritmos cuantitativos básicos de ImageJ para analizar los videos después de un experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando el sistema de flujo señalados anteriormente permite la generación de vídeos Time-lapse cuantitativas de biofilm hongos crecimiento y desarrollo. Para permitir comparaciones entre experimentos es de vital importancia para poder garantizar los parámetros de proyección de imagen son el mismo. Esto incluye asegurar que el microscopio está configurado para la iluminación Köhler para cada experimento (muchas guías están disponibles en línea para este proceso). Aparte de los parámetros de la proyección d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el Dr. Wade Sigurdson para proporcionar valiosas contribuciones en el diseño de los aparatos de flujo.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
Riferimenti
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
