Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים
Summary
פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.
Abstract
הקרנית כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ריפוי הפצע. היכולת ליצור ולהשתמש תאים בתרבית של ראשי שני מימד (2D) ואת שלושת ממדי (3D) תרבות יצר שפע של מידע לא רק על ביולוגיה הקרנית, אלא גם על הפצע ריפוי, ביולוגיה myofibroblast, וצלקות באופן כללי . המטרה של הפרוטוקול היא מערכת assay לכימות myofibroblast פיתוח, המאפיינת הצטלקות. נדגים איברים הקרנית תרבות שמחוץ דגם באמצעות העיניים חזיר. ב- keratectomy הקדמי זה פצע, קרניות עדיין בתוך העולם פצועים עם להב מעגלית הנקראת trephine. פקק של 1/3 של הקרנית הקדמי הוא הסיר כולל האפיתל, קרום המרתף של החלק הקדמי של stroma. לאחר פציעתו, קרניות לחתוך מהגלוב, רכוב על בסיס קולגן/אגר, תרבותי במשך שבועיים במדיום בחינם בתוספת-סרום יחודיי מיוצב להעצמת התפשטות תאים והפרשת מטריצה חוץ-תאית על ידי fibroblasts תושב. הפעלה של myofibroblasts ב stroma הקדמי ניכרת הקרנית נרפא. מודל זה יכול לשמש כדי assay הפצע הסגר, ההתפתחות של myofibroblasts וסמנים שהותירה ולאחר ללימודי הרעלים. בנוסף, ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה, כמו גם בתיווך השומנים siRNA תקנים עבור גנים יכול להיבדק במערכת זו.
Introduction
הצטלקות הקרנית הנובע פציעה, טראומה או זיהום יכול להוביל מתישה opacities, אובדן ראייה קבועים. לפיכך, יש צורך קריטי כדי לזהות מסלולים אשר ניתן לפלח התערבות טיפולית. אפשרויות הטיפול הנוכחי מוגבל, מורכב בעיקר השתלות הקרנית, אשר אינם נגישים לחולים ברחבי העולם. האדם (איור 1) והן לקרנית בעלי חיים יכול להיות מנוצל עבור דו-ממדי ולומד תרבית תאים 3D1,2. ניתן להשיג לקרנית גווייה האנושית לא מתאימה להשתלה העין בנקים או רקמות מרכזי בנקים (לאומי מחלות מחקר מחלף (NDRI)), עיניים חייתיות ניתן להשיג בית-מטבחיים. ראשי תאים אפיתל הקרנית, סטרומה fibroblasts ועוד לאחרונה, תאי אנדותל, יכול להיות מבודדת ותרבותית של רקמות אלה לריפוי הפצע ולא של הרעלים לימודים3,4,5. מעבר לחשיבות של הבנת הבסיס המולקולרי של מסנוור מחלת עיניים, הנגישות של רקמות ואת היכולת תרבות ראשי תאים הפך הקרנית מערכת מודל חשוב למחקר. הקרנית הוא אידיאלי עבור בחינת השפעת סוכנים על צלקות כפי הקרנית נורמלי הוא שקוף וליצור סוגים מסוימים של פצעים אטימות או שהותירה צלקות (נבדקה ב6). מספר ויוו הפצע הקרנית הריפוי מודלים יש גם בהרחבה מנוצל עבור צלקות מחקרים1. פחות מנוצל היה לשעבר vivo הקרנית פצע ריפוי מודל7,8 המתארים בפירוט כאן. המטרה של שיטה זו היא לכמת את התוצאות הצטלקות מאופיין על-ידי עושי שהותירה ב- 3D multicellular הקרנית ex-vivo מודל המערכת.
הקרנית אפיתל ופצעו זה אינו מפר קרום המרתף אפיתל בדרך כלל סוגר תוך 24-72 h9. זמן קצר לאחר פציעתו, התאים בקצה של האפיתל להתחיל להפיץ ושל העברת לתוך השטח חינם אפיתל, להקים מחדש את פונקציית מחסום האפיתל. פעילות זו ברצף ואחריו הפעלה של התפשטות התאים הבזליים הקרנית קודם, בשלב מאוחר יותר, של תאים קודמן ממוקם באיזור limbal החיצונית כדי להשיג התאוששות של תאים אפיתל המונים10,11. הפצעים האלו לעיתים קרובות לרפא ללא צלקות. עם זאת, פצע חודר קרום המרתף stroma לעיתים קרובות גורמת היווצרות צלקת1. לאחר ופצעו סטרומה הקרנית, מאוכלסת stroma תאים של מקורות מרובים כולל תושב סטרומה תאים, כמו גם הנגזרות מח עצם fibrocytes12,13,14. שהותירה צלקות מאופיין על ידי ההתמדה של myofibroblasts פצע ריפוי. אלה myofibroblasts פתולוגית להדגים אדהזיה מוגבר באמצעות ההצטברות של אינטגרינים הדבקויות מוקד, סיבי סטרס אקטין (α-SMA) השריר α חלקה כויץ ו ההפעלה המקומי של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-מבודד כמוס-צורה של גורם גדילה-בטא (TGFβ). הבידול של תאים אפיתל נגזר, המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (אמבולנס), עשויים לתרום גם צלקת היווצרות6.
יש איזון עדין בין תאית התמיינות אפופטוזיס לאחר פציעתו. בגלל הקרע בתוך קרום המרתף, צמיחה גורמים כמו פקטורי גדילה נגזר טסית (דם PDGF) ואת TGFβ מרוב דמעות האפיתל להתרחץ stroma, גרימת myofibroblast בידול, לולאה autocrine מתמשכת של הפעלת TGFβ, ו הפרשת לא מאורגן שהותירה ECM15,16. התמדתו של myofibroblasts בתוך הפצע נרפא מקדם אובך, הצטלקות הקרנית (איור 2). עם זאת, ב- regeneratively נרפא פצע למרות myofibroblasts לפתח, הם apoptose, ובכך הם נעדרים או מספר מופחת באופן משמעותי ברקמה בריאה (נבדקה תוך התייחסות6,10). לפיכך, מחקר על שהותירה צלקות התמקדה לפחות בחלקו מיקוד מולקולות המונעים התפתחות myofibroblast מוגזמת או myofibroblast התמדה17,18. כי התמדה myofibroblast מאפיינת במחלה וצלקות וגם שהותירה רקמות כל19, הקרנית עשויה להועיל כמערכת מודל ללמוד כללי המנגנונים התאיים של פיברוזיס.
במערכת מודל שלנו, הקרנית פצוע עם להב גלילי המכונה trephine בעוד עדיין בתוך העולם. בני אדם ונפצעו חזיר לקרנית יכול להיות עם גם 6 או 7 מ מ trephine; ארנב לקרנית trephine 6 מ מ היא המועדפת. הקרנית חזיר דומה בגודל של הקרנית האנושית. כי הן חסכוניות וזמין במספרים גדולים, החזיר את הקרנית משמשים באופן שגרתי לתרבות איברים. יתר על כן, נוגדנים, siRNAs עשוי להגיב עם האדם יש בעקביות cross-reacted עם חזיר7. לאחר פציעתו, קרניות מנותקים מן העולם עם לימבוס ללא פגע, רכוב על אגר/קולגן הבסיס. קרניות הן בתרבית בתקשורת ללא סרום פלוס התייצב ויטמין C כדי לדמות פיברובלסט התפשטות ו- ECM התצהיר20. התוספת של סרום ולא גורמי גדילה לא נחוצים כדי לעודד היווצרות myofibroblast7. לקרנית באופן שגרתי קבוע, מעובד עבור היסטולוגיה לאחר שבועיים של תרבות. עבור גנים, או כדי לבדוק את ההשפעות של סוכן על ריפוי הפצע, הפצע יכולים להיות מטופלים עם siRNA בפצע לאחר ופצעו7 או סוכן מסיסים יכולים להתווסף לתקשורת, בהתאמה8.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מודל לימוד ריפוי הפצע בסביבה תלת-ממד מרובדת טבעית. השימוש של תרבות איברים כמו ביניים בין תרבית תאים ולימודי ויוו מפחיתה באופן משמעותי את עלויות, כמו גם הליכי הפחתת בבעלי חיים. דגמי תלת-ממד אחרים להיות היתרון הגדול לשדה כולל עצמי סינתזה קולגן ג’לים זני העיקרי fibroblasts הקרנית ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH-NEI R01 EY024942, מחקר כדי למנוע עיוורון, בצפון לרפואה אוניברסיטת בלתי מוגבלת וקרנות מחקר, ואת מחוז אריות 20-י’ מיקרוסקופ וניתוח תמונה של פרפין סעיפים בוצעו בתוך ליבת מיקרוסקופ, הכנת שקופית היסטולוגית בוצעה Biorepository, פתולוגיה הליבה בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני.
Materials
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera | |
Riferimenti
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
- Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
- Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
- Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
- Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
- Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
- Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
- Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
- Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
- Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
- White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
- Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
- Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
- Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
- Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
- Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
- Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
- Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
- Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
- Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).
