Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios
Summary
Un protocolo para un ex vivo modelo de cultura órgano córneo es útil para estudios de cicatrización se describe. Este sistema modelo puede utilizarse para evaluar los efectos de agentes para promover la curación regenerativa o toxicidad de la droga en un ambiente organizado de multicelular 3D.
Abstract
La córnea se ha utilizado extensivamente como modelo para el estudio de la cicatrización de heridas. La capacidad de generar y utilizar las células primarias de mamíferas en dos dimensiones (2D) y tres dimensiones cultura de (3D) ha generado una riqueza de información sobre biología corneal sobre la herida cura, biología de miofibroblastos y cicatrices en general . El objetivo del protocolo es un sistema de análisis para cuantificar el desarrollo de miofibroblastos, que caracteriza a marcar con una cicatriz. Demostramos un órgano córneo cultura vivo ex modelo con ojos de cerdo. En este anterior keratectomy herida, córneas todavía en el mundo son heridas con una cuchilla circular que se llama un trépano. Se quita un tapón de aproximadamente 1/3 de la córnea anterior incluyendo el epitelio, la membrana del sótano y la parte anterior del estroma. Después de herir, córneas son corta del mundo, montadas sobre una base de colágeno/agar y cultivadas durante dos semanas en medio libre de suero complementado con estabilizado vitamina C para aumentar la proliferación celular y la secreción de matriz extracelular por los fibroblastos residentes. Activación de miofibroblastos en el tejido conectador anterior es evidente en la córnea curada. Este modelo puede utilizarse para análisis de encierro de la herida, el desarrollo de miofibroblastos y marcadores fibróticos y para estudios de Toxicología. Además, los efectos de los inhibidores de molécula pequeña como transfección mediada por lípidos siRNA por caída de gene se pueden probar en este sistema.
Introduction
Marcar con una cicatriz en la córnea debidos a lesión, trauma o infección puede conducir a debilitante opacidad y pérdida de visión permanente. Así, hay una necesidad crítica para identificar los caminos que pueden ser objeto de intervención terapéutica. Opciones actuales de tratamiento son limitadas y consisten principalmente en trasplantes córneas, que no son accesibles a los pacientes en todo el mundo. Humanos (figura 1) y córneas animales pueden ser utilizadas para 2D y estudios de cultivo celular 3D1,2. No apto para trasplante de córneas de cadáver humano pueden obtenerse de bancos de ojos o de bancos de tejidos centralizada (nacional enfermedad investigación intercambio (NDRI)), y los ojos animales pueden obtenerse en un matadero. Las células epiteliales corneales primarias, fibroblastos estromales y más recientemente, las células endoteliales, pueden aisladas y cultivadas de estos tejidos para la cicatrización de Toxicología estudios y3,4,5. Además de la importancia de comprender la base molecular de ceguera ojo, la accesibilidad del tejido y la capacidad de las células primarias de cultura ha hecho la córnea un sistema modelo importante para el estudio. La córnea es ideal para probar los efectos de los agentes en la cicatrización de la córnea normal es transparente y ciertos tipos de heridas crean opacidades o cicatrices fibróticas (revisadas en6). Varios en vivo herida corneal cicatrización modelos también se han utilizado extensivamente para estudios1marcar con una cicatriz. Menos utilizado ha sido el ex vivo cornea herida curativo modelo7,8 que se describen en detalle aquí. El objetivo de este método es cuantificar resultados de cicatrización caracterizados por los fabricantes fibróticos en un 3D multicelulares córnea ex sistema de modelo vivo.
Heridas epiteliales corneales que no romper la membrana basal epitelial normalmente se cierra en 24-72 h9. Pronto después de la herida, las células en el borde del epitelio comienzan separarse y migrar a la superficie epitelial libre, para restablecer la función barrera epitelial. Esta actividad es seguida secuencialmente por la activación de la proliferación celular basal corneal primero y, en una etapa posterior, de células precursoras, ubicado en la zona limbal externa para lograr la recuperación de la célula epitelial masiva10,11. A menudo estas heridas sanan sin dejar cicatrices. Sin embargo, una herida que penetra la membrana del sótano en el estroma, a menudo resulta en la formación de cicatriz1. Después de herir stromal córnea, el estroma se rellena con las células de múltiples orígenes como distinguidas residente células stromal y fibrocitos médula ósea12,13,14. Marcar con una cicatriz fibrótica se caracteriza por la persistencia de myofibroblasts en una herida curativa. Estos miofibroblastos patológicos demuestran mayor adherencia a través de la acumulación de las integrinas en adherencias focales, fibras de tensión contráctil del músculo liso de la α actina (α-SMA) y la activación local de la matriz extracelular (ECM)-secuestrado latente de la transformación del factor de crecimiento beta (TGFβ). La diferenciación de las células epiteliales derivadas, conocido como epitelio de transición mesenquimal (EMT), también puede contribuir a la formación6la cicatriz.
Hay un delicado equilibrio entre la diferenciación celular y apoptosis después de herir. Debido a la brecha en la membrana basal, factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y TGFβ de lágrimas y el epitelio bañan del estroma, induce diferenciación de miofibroblastos, un bucle autocrino sostenida de la activación de TGFβ y la secreción de desorganizado fibrótica ECM15,16. La persistencia de los miofibroblastos en la herida curada promueve haze y marcar con una cicatriz en la córnea (figura 2). Sin embargo, en re-generativa curado la herida aunque desarrollar myofibroblasts, apoptose y así son ausentes o significativamente reducidas en número en el tejido curado (revisado en la referencia6,10). Así, investigación sobre cicatrización fibrótica ha enfocado al menos en parte dirigidos a moléculas que impiden el desarrollo excesivo de miofibroblastos o miofibroblastos persistencia17,18. Debido a persistencia de miofibroblastos caracteriza enfermedad cicatrización y fibrótica en todos los tejidos19, la córnea puede ser útil como un sistema modelo para estudiar los mecanismos celulares generales de fibrosis.
En nuestro sistema modelo, la córnea es herida con una cuchilla cilíndrica llamada trépano mientras que todavía en el mundo. Humano y córneas de cerdo pueden ser heridas con cualquiera de los dos un 6 o 7 mm trépano; para córneas de conejo un trépano de 6 mm se prefiere. La córnea de cerdo es similar en tamaño a la córnea humana. Porque son rentables y fácilmente disponibles en números grandes, córneas de cerdo se utilizan habitualmente para el cultivo. Además, constantemente han inducían anticuerpos y siRNAs hicieron reaccionar con humanos con cerdo7. Después de herir, córneas se cortan del globo con el limbo intactas y montado en una base de agar/colágeno. Las córneas son cultivadas en medios libres de suero además de estabilizaron de vitamina C para simular la proliferación del fibroblasto y la deposición de ECM20. La adición de suero ni factores de crecimiento son necesarias para inducir la formación de miofibroblastos7. Córneas son rutinariamente fijadas y procesadas para histología después de dos semanas de la cultura. Por caída de gene, o para probar los efectos de un agente en la cicatrización de la herida, la herida puede ser tratada con siRNA en la herida después de herir a7 o un agente soluble puede añadirse a los medios de comunicación, respectivamente8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un modelo para el estudio de la cicatrización de heridas en un entorno 3D estratificado natural. Uso de cultivo como intermediario entre la cultura de célula y estudios in vivo reduce significativamente los costos, así como reducir procedimientos en animales vivos. Otros modelos 3D han sido de gran beneficio para el campo, incluyendo la síntesis de geles de colágeno de fibroblastos corneales humanas primaria2 o estas mismas células embebidas en geles de colágenos ori…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NEI NIH R01 EY024942, investigación para prevenir la ceguera, Upstate médica Universidad Libre fondos de investigación, y leones distrito 20-Y. microscopía y análisis de imágenes de secciones de la parafina se realizaron en el centro de microscopía y preparación de los portaobjetos histológico fue realizado en el biorepositorio y la base de la patología en la Facultad de medicina de Icahn en el Monte Sinaí.
Materials
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera | |
Riferimenti
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