Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi
Summary
Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.
Abstract
La cornea è stata utilizzata ampiamente come sistema modello per studiare la guarigione della ferita. La capacità di generare ed utilizzare le cellule di mammifero primarie in due dimensioni (2D) e tridimensionali (3D) tre cultura ha generato una ricchezza di informazioni non solo sulla biologia della cornea, ma anche sulla ferita guarigione, biologia dei miofibroblasti e cicatrici in generale . L’obiettivo del protocollo è un sistema di test per quantificare lo sviluppo dei miofibroblasti, che caratterizza lo sfregio. Dimostriamo un organo corneale cultura ex vivo modello utilizzando maiale occhi. In questo keratectomy anteriore ferita, cornee ancora nel globo sono ferite con una lama circolare chiamata un trephine. Una spina di circa 1/3 della cornea anteriore viene rimosso compreso l’epitelio, la membrana dello scantinato e la parte anteriore dello stroma. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo, montate su una base di collagene/agar e coltivate per due settimane in mezzo libero siero integrato con vitamina C stabilizzata per aumentare la proliferazione delle cellule e la secrezione extracellulare dai fibroblasti residente. Attivazione dei miofibroblasti nello stroma anteriore è evidente nella cornea guarita. Questo modello può essere utilizzato di saggiare la chiusura della ferita, lo sviluppo di miofibroblasti e fibrotici marcatori e per gli studi di tossicologia. Inoltre, gli effetti di piccole molecole inibitrici, come pure la transfezione di siRNA del lipido-mediata per atterramento di gene possono essere analizzati in questo sistema.
Introduction
Cicatrici nella cornea derivanti da lesioni, traumi o infezione può portare a debilitante opacità e perdita permanente della vista. Così, c’è una necessità critica di individuare percorsi che possono essere oggetto di intervento terapeutico. Opzioni correnti di trattamento sono limitate e sono costituiti principalmente di trapianti corneali, che non sono accessibili ai pazienti in tutto il mondo. Sia umani (Figura 1) e cornee animale possono essere utilizzate per il 2D e coltura cellulare 3D studi1,2. Non adatto per il trapianto di cornee cadavere umano possono essere ottenute da banche degli occhi o le banche di tessuti centralizzata (nazionale malattia ricerca Interchange (NDRI)), e gli occhi degli animali possono essere ottenuti da un mattatoio. Primarie di cellule epiteliali corneale e più recentemente, le cellule endoteliali, fibroblasti stromal può essere isolato e coltivato da questi tessuti per la guarigione della ferita e tossicologia studi3,4,5. Oltre all’importanza di comprendere le basi molecolari di malattia dell’occhio di accecante, l’accessibilità del tessuto e la capacità di cellule primarie di cultura ha reso la cornea un importante sistema modello per lo studio. La cornea è ideale per testare gli effetti di agenti su cicatrici come la cornea normale è trasparente e certi tipi di ferite creano opacità o cicatrici fibrotiche (rivisto in6). Diversi in vivo della ferita corneale guarigione modelli inoltre sono stati utilizzati estesamente per cicatrici studi1. Meno utilizzati è stato l’ex vivo cornea ferita guarigione modello7,8 che è descrivere in dettaglio qui. L’obiettivo di questo metodo è quello di quantificare i risultati sfregio caratterizzati dai creatori fibrotiche in un 3D multicellulari corneale ex vivo modello di sistema.
Ferendo epiteliale corneale che non violano la membrana basale epiteliale normalmente si chiude entro 24-72 h9. Presto dopo la ferita, le cellule al bordo dell’epitelio iniziare la diffusione e la migrazione in superficie epiteliale libera, per ristabilire la funzione di barriera epiteliale. Questa attività in sequenza è seguita dall’attivazione di proliferazione delle cellule basali corneale prima e, in una fase successiva, di cellule precursori situato presso la zona limbal esterna per ottenere il recupero di cellule epiteliali massa10,11. Queste ferite spesso guariscono senza lasciare cicatrici. Tuttavia, una ferita che penetra la membrana dello scantinato dello stroma spesso comporta cicatrice formazione1. Dopo la ferita corneale stromale, lo stroma è popolato con cellule di origini multiple tra cui differenziate cellule stromale residenti così come derivate da midollo osseo fibrociti12,13,14. Cicatrici fibrotiche è caratterizzata dalla persistenza di myofibroblasts in una guarigione della ferita. Questi myofibroblasts patologico dimostrare adesione aumentata attraverso l’accumulo delle integrine nell’adesioni focali, fibre contrattili α-liscia del muscolo actina (α-SMA) stress e attivazione locale della matrice extracellulare (ECM)-sequestrato trasformazione di latente crescita fattore-beta (TGFβ). La differenziazione delle cellule epiteliali derivate, noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), può anche contribuire per cicatrice formazione6.
C’è un delicato equilibrio tra differenziazione cellulare e l’apoptosi dopo la ferita. A causa della violazione nella membrana dello scantinato, fattori di crescita come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e TGFβ da lacrime e l’epitelio si bagnano lo stroma, inducendo la differenziazione dei miofibroblasti, un loop autocrino sostenuta di attivazione del TGFβ e la secrezione di disorganizzato fibrotica ECM15,16. La persistenza dei miofibroblasti nella ferita guarita promuove haze e cicatrici nella cornea (Figura 2). Tuttavia, in regeneratively guarito ferita anche se sviluppano miofibroblasti, essi apoptose e così sono assenti o significativamente ridotto in numero nel tessuto guarito (rivisto in riferimento6,10). Così, ricerca su cicatrici fibrotiche si è concentrata, almeno in parte sul targeting molecole che impediscono lo sviluppo eccessivo dei miofibroblasti o myofibroblast persistenza17,18. Perché myofibroblast persistenza caratterizza la malattia sia sfregio e fibrotica in tutti tessuti19, la cornea può essere utile come sistema modello per lo studio dei meccanismi cellulari generali di fibrosi.
Nel nostro sistema di modello, la cornea è ferita con una lama cilindrica chiamata un trephine mentre ancora nel globo. Umano e cornee di maiale possono essere ferite con entrambi un trephine 6 o 7 mm; per le cornee coniglio un trephine 6mm è preferito. La cornea di maiale è simile a quello della cornea umana. Perché essi sono efficaci e prontamente disponibili in gran numero, cornee di maiale sono abitualmente utilizzate per la coltura di organo. Inoltre, gli anticorpi e siRNA fatti reagire con umani hanno costantemente traversa-ha reagito con maiale7. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo con il limbus intatte e montato su un base di agar/collagene. Le cornee sono coltivate in terreni privi di siero più stabilizzata di vitamina C per simulare la proliferazione dei fibroblasti e la deposizione di ECM20. L’aggiunta di siero né fattori di crescita sono necessari per indurre myofibroblast formazione7. Le cornee sono ordinariamente fissa e trattate per istologia dopo due settimane di cultura. Per atterramento di gene, o per testare gli effetti di un agente sulla guarigione delle ferite, la ferita può essere trattata con siRNA nella ferita dopo che7 o un agente di purificazione può essere aggiunto ai media, rispettivamente8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un modello di studio della guarigione della ferita in un ambiente naturale di 3D stratificato. Uso della cultura di organo come intermedio tra coltura cellulare e gli studi in vivo riduce significativamente i costi, nonché riducendo le procedure sugli animali vivi. Altri modelli 3D sono stati di grande beneficio per il campo tra cui self-sintetizzazione gel di collagene in fibroblasti corneali umano primario2 o queste stesse cellule incorporati in gel fatto da collageni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH-nia R01 EY024942, ricerca per prevenire la cecità, Upstate Medical University senza restrizione ricerca fondi, e distretto Lions 20-Y. microscopia e analisi delle immagini di sezioni della paraffina sono state eseguite presso il nucleo di microscopia e preparazione del vetrino istologico è stata eseguita la Biorepository e CORE di patologia presso la scuola di medicina di Icahn al Mount Sinai.
Materials
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera | |
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