Ex Vivo sårheling hornhinde orgel kultur Model for undersøgelser
Summary
En protokol til en ex vivo hornhinde orgel kultur model nyttigt for sårheling undersøgelser er beskrevet. Denne modelsystem kan bruges til at vurdere virkningerne af agenter til at fremme regenerativ heling eller lægemiddeltoksicitet i en organiseret 3D flercellede miljø.
Abstract
Hornhinden er blevet brugt flittigt som et modelsystem til at studere sårheling. Evnen til at generere og udnytte primære pattedyrsceller i to-dimensionelle (2D) og tre-dimensionelle (3D) kultur har genereret et væld af oplysninger ikke blot om hornhinde biologi, men også om sår healing, myofibroblast biologi, og ardannelse i almindelighed . Målet med protokollen er en assay system til kvantificering af myofibroblast udvikling, der kendetegner ardannelse. Vi demonstrere en hornhinde orgel kultur ex vivo model ved hjælp af gris øjne. I denne forreste keratectomy sår, såret hornhinder stadig i verden med en cirkulær blade kaldes en trephine. Et stik af ca 1/3 af den forreste hornhinden er fjernet, herunder epitel, basalmembranen og den forreste del af stroma. Efter såret, er hornhinder skåret fra hele kloden, monteret på et kollagen/agar base og kulturperler i to uger suppleret serum gratis medium med stabiliseret vitamin C at forøge celleproliferation og ekstracellulære matrix sekretion af hjemmehørende fibroblaster. Aktivering af myofibroblasts i den forreste stroma er tydelig i helede hornhinden. Denne model kan bruges til at analyse sår lukning, udvikling af myofibroblasts og fibrotisk markører og til toksikologiske undersøgelser. Derudover kan virkningerne af lille molekyle hæmmere samt lipid-medieret siRNA Transfektion for gen knockdown testes i dette system.
Introduction
Ardannelse i hornhinden som følge af skade, traume eller infektion kan føre til invaliderende opaciteter og permanent synstab. Der er således et kritisk behov for at identificere veje, der kan målrettes for terapeutisk intervention. Nuværende behandlingsmuligheder er begrænset og består primært af cornea transplantationscentre, som ikke er tilgængelige for patienter i hele verden. Både menneskelige (figur 1) og animalske hornhinder kan udnyttes til 2D og 3D cellekultur studier1,2. Menneskelige Kadaver hornhinder ikke egnet til transplantation kan fås fra øjet banker eller centraliseret vævsbanker (nationale sygdom forskning Interchange (NDRI)), og dyrs øjne kan fås fra et slagteri. Primære hornhinde epitelceller, stromale fibroblaster og mere for nylig, endotelceller, kan isoleres og kulturperler fra disse væv for sårheling og toksikologiske undersøgelser3,4,5. Ud over betydningen af forståelse af det molekylære grundlag af blændende øjensygdom, gjort adgangen til væv og evnen til at kultur primærelementer hornhinden en vigtig modelsystem for undersøgelse. Hornhinden er ideel til at teste virkningerne af agenter på ardannelse som normale hornhinden er gennemsigtig og visse typer af sår oprette opaciteter eller fibrotisk ar (gennemgik i6). Flere i vivo hornhinde sår healing modeller har også udnyttet flittigt for ardannelse undersøgelser1. Mindre udnyttede har været i ex vivo hornhinde sår healing model7,8 der er beskriver i detaljer her. Målet med denne metode er at kvantificere ardannelse resultater karakteriseret ved fibrotisk beslutningstagere i en 3D flercellede hornhinde ex vivo modelsystem.
Hornhindens epitel sårede, der ikke overstiger den epitel basalmembranen normalt lukker inden for 24-72 h9. Snart efter sårede starte celler på kanten af epitel spredning og overflytning i epitelial gratis overfladen, for at genoprette epitel barriere funktion. Denne aktivitet er sekventielt efterfulgt af aktivering af cornea basalcelle spredning først, og i en senere fase, forløber celler beliggende på ydre limbal zone at opnå tilbagebetaling af epitelcelle masse10,11. Disse sår helbrede ofte uden ardannelse. Dog resulterer et sår, der trænger ind basalmembranen i stroma ofte i ar dannelse1. Efter hornhindens stroma sårede, er stroma befolket med celler af flere oprindelse herunder differentierede bosiddende stromale celler samt knoglemarv-afledte fibrocytes12,13,14. Fibrotisk ardannelse er karakteriseret af persistens af myofibroblasts i en helbredende såret. Disse patologiske myofibroblasts vise øget friktion gennem akkumulering af integriner i fokale sammenvoksninger, kontraktile α-glat-muskel aktin (α-SMA) stress fibre og lokal aktivering af ekstracellulære matrix (ECM)-afsondret latent-omdanne vækst faktor-beta (TGFβ). Differentiering af epitel-afledte celler, kendt som epitelial mesenchymale overgangen (EMT), kan også bidrage til at ar dannelse6.
Der er en hårfin balance mellem Celledifferentiering og apoptose efter såret. På grund af brud i basalmembranen, vækst faktorer såsom Trombocyt-afledt vækst faktor (PDGF) og TGFβ fra tårer og epitel bade stroma, inducerende myofibroblast differentiering, en vedvarende autocrine løkke i TGFβ aktivisering, og den sekretion af uorganiseret fibrotisk ECM15,16. Persistens af myofibroblasts i det helede sår fremmer haze og ardannelse i hornhinden (figur 2). Dog i regeneratively helede sår selvom myofibroblasts udvikle, de apoptose og dermed er fraværende eller væsentligt reduceret i antal i de helbredt væv (gennemgik i reference6,10). Forskning på fibrotisk ardannelse har således fokuseret i det mindste delvis på målretning molekyler, der forhindrer overdreven myofibroblast udvikling eller myofibroblast persistens17,18. Fordi myofibroblast persistens kendetegner både ardannelse og fibrotisk sygdom i alle væv19, kan hornhinden være nyttig som et modelsystem til at studere almindelige cellulære mekanismer af fibrose.
I vores modelsystem, er hornhinden såret med en cylindrisk kniv kaldet en trephine mens stadig i verden. Menneskelige og gris hornhinder kan blive såret med enten en 6 eller 7 mm trephine; for kanin hornhinder foretrækkes en 6 mm trephine. Gris hornhinden er nogenlunde samme størrelse som den menneskelige hornhinden. Fordi de er omkostningseffektive og let tilgængelige i stort tal, er svin hornhinder rutinemæssigt anvendes for orgel kultur. Derudover har antistoffer og siRNAs gjort at reagere med menneskelige konsekvent cross-reacted med gris7. Efter at have såret, hornhinder er skåret fra hele kloden med limbus intakt og monteret på en agar/kollagen base. Hornhinder er kulturperler i serumfrit media plus stabiliseret vitamin C for at simulere fibroblast spredning og ECM deposition20. Hverken tilsætning af serum eller vækstfaktorer er nødvendige for at fremkalde myofibroblast dannelse7. Hornhinder er rutinemæssigt fast og forarbejdet til histologi efter to ugers kultur. Gen knockdown eller afprøve virkningerne af en agent for sårheling, såret kan behandles med siRNA i såret efter såret7 eller en opløselig agent kan føjes til medierne, henholdsvis8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en model for at studere sårheling i en stratificeret 3D natur. Brug af orgel kultur som en mellemting mellem cellekultur og in vivo-undersøgelser reducerer omkostninger samt reducere procedurer på levende dyr. Andre 3D modeller har været til stor gavn for feltet herunder selv syntetisere kollagen geler fremstillet af primære menneskelige hornhinde fibroblaster2 eller disse samme celler der er indlejret i geler fremstillet af dyr-afledte collagens31</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH-NEI R01 EY024942, forskning for at forebygge blindhed, Upstate medicinske universitet ubegrænset forskningsmidler, og Lions distrikt 20-Y. mikroskopi og billedanalyse af paraffinsnit blev udført kernen mikroskopi og histologiske dias forberedelse blev udført på Biorepository og patologi CORE på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
Materials
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera | |
Riferimenti
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
- Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
- Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
- Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
- Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
- Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
- Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
- Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
- Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
- Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
- White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
- Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
- Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
- Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
- Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
- Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
- Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
- Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
- Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
- Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).
