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Neuroscience

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/58792
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch, 2The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research, University of Texas Medical Branch

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Methoden für ex-Vivo vaskuläre Reaktivität Bestimmung nach einer primären Explosion traumatische Hirnverletzungen (bTBI) mit isoliert, unter Druck, Nagetier mittleren zerebralen arteriellen (MCA) Segmenten zu beschreiben. bTBI Induktion erfolgt mit einem Schock-Rohr, auch bekannt als eine erweiterte Explosion Simulator (ABS) Gerät.

Abstract

Obwohl auf die histopathologischen und behavioralen Auswirkungen einer Explosion es Studien gab, haben weniger Explosion die zerebrale vaskuläre Effekte gewidmet. Auswirkungen (z. B., nicht-Blast) traumatische Hirnverletzungen (TBI) ist bekanntermaßen Druck Selbstregelung in der zerebralen Vasculature bei Menschen und Versuchstieren zu verringern. Die Hypothese, dass die Explosion verursachten traumatische Hirnverletzungen (bTBI), wie TBI, Einfluss beeinträchtigt zerebrale vaskuläre Reaktivität führt wurde durch Messung myogen dilatorisch Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck in Nagetier mittleren zerebralen arteriellen (MCA) getestet Segmente von Ratten milde bTBI verwenden eine erweiterte Explosion Simulator (ABS) Schock Röhre ausgesetzt. Erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley Ratten wurden betäubt, intubiert, belüftet und Sham bTBI (identische Manipulation und Anästhesie mit Ausnahme von Blast Verletzungen) oder milde bTBI vorbereitet. Ratten wurden randomisiert, Sham bTBI oder milde bTBI gefolgt von Opfer 30 oder 60 min nach der Verletzung zu erhalten. Unmittelbar nach bTBI aufrichtenden reflex (RR) Unterdrückung mal bewertet wurden, Euthanasie in der Zeit Punkte nach der Verletzung wurde fertiggestellt, das Gehirn wurde geerntet und MCA-Segmente wurden gesammelt, montiert und unter Druck gesetzt. Da die Intraluminal Druck durch die arterielle Segmente durchblutet in Schritten von 20 MmHg von 100 auf 20 MmHg reduziert wurde, waren MCA Durchmesser gemessen und aufgezeichnet. Mit abnehmender Intraluminal Druck, MCA Durchmesser stetig deutlich über dem Ausgangswert in den Schein bTBI Gruppen während MCA Dilatator Antworten deutlich reduziert wurden (p < 0,05) in beiden bTBI Gruppen wie belegt die Sehstörungen, kleinere MCA-Durchmesser für bTBI Gruppen aufgenommen. Darüber hinaus war RR Unterdrückung in den bTBI Gruppen signifikant (p < 0,05) höher als in den Schein bTBI Gruppen. MCA ist gesammelt von Sham bTBI Druck Gruppen ausgestellte typische gefäßerweiternde Eigenschaften zu einer Abnahme in Intraluminal Druck während MCAs nach bTBI deutlich ausgestellt gesammelt myogen gefäßerweiternde Antworten beeinträchtigt reduziert, die blieb für mindestens 60 min. nach bTBI.

Introduction

Ähnlich, der sich aus den Auswirkungen (z. B., nicht-Blast) TBI, Blast-induzierte traumatische Hirnverletzungen (bTBI) hat zerebrale Gefäßverletzung1 zugeordnet und beeinträchtigt wie zerebrale vaskuläre kompensatorische Reaktionen auf Ereignisse Veränderungen in der Partialdruck von Kohlendioxid (PaCO2)2,3,4 und Sauerstoff (PaO2)5. Darüber hinaus hat Blast Exposition in Tiere6 und bTBI Patienten7,8zerebralen arteriellen Vasospasmen verursacht. Während klinische TBI9 und Flüssigkeit-Percussion Verletzungen (FPI)10,11,12 des arteriellen Blutdrucks beeinträchtigt zerebrale vaskuläre Reaktionen auf Änderungen zugeordnet sind (z. B., Druck Selbstregelung)9,10,11,12, Unsicherheiten bezüglich der Auswirkungen von bTBI auf zerebrale vaskuläre Druckleistung Selbstregelung.

Der zerebrale Durchblutung reagiert auf Schwankungen im systemischen arteriellen Druck mit der Absicht der Aufrechterhaltung einer kontinuierlichen Sauerstoff und Nährstoffversorgung an die metabolisch aktiven Gehirn13,14,15geliefert, 16. Eine einzigartige Art der Homöostase, Selbstregelung17,18,19 tritt auf, wenn "ein Organ einen ständigen Blutfluss trotz Änderungen im Blutdruck (Perfusion) oder andere physiologische oder pathologische Reize unterhält" 20. zerebrale Arterien verengen oder erweitern in Reaktion auf Veränderungen des Blutdrucks, Stickstoffmonoxid (NO), Viskosität des Blutes, PaCO2 und PaO2, usw.4,11,16, 21. arterielle myogen Antwort bezieht sich auf solche Kontraktionen oder Streckungen. Die myogen vaskuläre Antwort, erstmals beschrieben von Bayliss22 und einen wichtigen Mechanismus zur Selbstregelung der CBF, zeichnet sich durch Vasokonstriktion steigt Perfusionsdruck und Gefäßerweiterung Perfusionsdruck sinkt 14 , 17. diese vaskuläre Reaktion ist die angeborene Fähigkeit der kontraktilen Gewebe (z. B. vaskulären glatten Muskelzellen, VSMC der) zu reagieren, zu dehnen und/oder Änderungen im Lumen und/oder Wand Spannung23,24, 25,26,27,28,29. Wenn Arterien gestreckt sind (z. B., während des intravaskulären Druck erhöht), VSMCs verengen24,25,26,28.

Studien, die Widerstand Schiffe prüfen ex Vivo haben häufig eine der beiden Methoden für die Prüfung der pharmakologischen und physiologische Eigenschaften der isolierten Widerstand Schiffe eingesetzt: der Ring montiert-Methode und der kanülierte unter Druck Methode. Der Ring montiert Schiff Vorbereitung Methode besteht darin, zwei Drähte, die Intraluminally durch das Schiff Segment übergeben die Segment in Position zu halten. Messung der Menge der Krafteinwirkung auf den isometrisch nachhaltigen Drähten misst die Stimulation der VSMC. Aber diese Technik birgt gewisse Vorbehalte, vor allem den unvermeidlichen erlittenen Schäden durch die endotheliale Schicht des lumens als die Drähte durchlaufen sind30 und das unterschiedliche Ausmaß der Dehnung, getragen von der isolierten Gruppe Das wiederum führt zu Schiff Wand Distension, letztlich Auswirkungen auf das Schiff Sensibilität für pharmakologische Wirkstoffe31. Kanülierte, unter Druck stehende Behälter Vorbereitung Methode nutzt eine Arteriograph bestehend aus zwei getrennten Kammern, die jedes Haus die Platzierung von einem mittleren zerebralen arteriellen (MCA) von einem einzigen Tier geerntet. Eine Mikropipette wird in jedem Ende des Segments eingefügt, das proximale Ende des Segments der Mikropipette mit Nähten befestigt wird und das Lumen ist sanft mit einer physiologischen Salzlösung (PSS) durchströmt, um Blut und andere Substanzen zu beseitigen. Das distale Ende wird mit Nähten befestigt. Transmural oder luminalen Druck gesetzt durch die Erhöhung der beiden Stauseen befestigt jede Pipette in eine passende Höhe oberhalb jedes Segment aber in unterschiedlichen Höhen in Bezug auf die anderen32,33,34,35 ,36. Druckaufnehmer entlang der Stauseen und Mikropipetten bieten Perfusion Druckmessungen, während Schiffe sind mit einem inversen Mikroskop mit Monitor, Video-Kamera und ermöglicht für die Messung der externen Scaler ausgestattet vergrößert MCA-Durchmessern. Obwohl beide Methoden wertvolle sind, kanülierte, unter Druck stehende Behälter Vorbereitung Methodik besser imitiert und Genehmigungen die Gefäße untersucht, um näher an ihre in Vivo Bedingungen32,37.

Die Auswirkungen der verschiedenen Arten von Auswirkungen (z. B., nicht-Blast) TBI auf zerebrale vaskuläre Antworten zuvor im zerebralen arteriellen Segmente21,35,36,38untersucht worden. Mit einer ähnlichen ex Vivo-MCA-Protokoll für Schiff Sammlung, Montage und Perfusion wie in der aktuellen Studie beschrieben, erzielt frühere Studien Erfolg mit ihren jeweiligen Untersuchungen in der damit verbundenen Mechanismen der zerebralen Vasculature Dysfunktion folgenden TBI. Golding Et Al.34 untersucht endothelial vermittelte Streckungen im Erwachsenen, männlichen Long-Evans Ratte MCA folgt strengen TBI durch kontrollierte kortikalen Auswirkungen (CCI) Verletzungen. In einer zweiten Studie, Golding Et Al.36 untersucht cerebrovaskuläre Reaktivität, Hypotonie oder CO2 nach der Ernte der MCA von Ratten, die eine milde CCI erlitten. Yu Et Al.38 analysiert, ob Peroxynitrit Radikalfänger verbesserte zögerliche Antworten auf intravaskulären Druck im Erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley Ratten MCA Segmente FPI ausgesetzt reduziert, während Mathew Et Al.21 myogen Antworten zu untersucht Hypotonie in MCA ist nach moderat, geerntet zentrale FPI.

Um besser die Hypothese untersucht, dass bTBI, wie nicht-Blast TBI, führt zu eingeschränkter zerebrale vaskuläre Reaktivität, testeten wir einen Mechanismus zur kompromittierten Selbstregelung durch Messung myogen zögerliche Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck Ex-Vivo in isolierten, unter Druck stehende Nagetier MCA Segmenten (Abbildung 1) von Ratten ausgesetzt, milde bTBI anhand eines erweiterten Blast Simulator (ABS) Schock Röhre (Abbildung 2 und Abbildung 3) gesammelt (siehe Rodriguez Et Al.39 Tabelle 1) verwendet Druckluft direkt an einer Fahrer-Kammer, Freidlander-artigen40 über und unter Hochdruck zu erzeugen Wellen geliefert (siehe Rodriguez Et Al.39Abb. 1A).

Figure 1
Abbildung 1 : Lage des mittleren zerebralen Arterien (MCA). Ventrale Ansicht der Rattengehirn markieren die Lage der MCA relativ zum hinteren Hirnarterien (PCA), interne Halsschlagadern (ICA), externe Halsschlagadern (ECA), a. basilaris (BA) und gemeinsame Halsschlagadern (CCA). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Erweiterte Explosion Simulator (ABS) Rohr Stoßsicherung. Das ABS verwendet, um primäre Blast Verletzungen bei allen Tieren der Studie zu produzieren. 1 = Fahrer Kammer; 2 = Expansionskammer;  3 = Probenkammer; 4 = reflektierte Welle Suppressor; gelber Stern = Probentablett. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

Alle experimentelle Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Texas Medical Branch, ein Verein zur Beurteilung genehmigt und Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Einrichtung.

(1) tierische Vorbereitung für ABS Blast Verletzungen

  1. Schalten Sie mechanische Nagetier Volumen Ventilator und Atemfrequenz zwischen 40-45 Atemzüge / min. eingestellt.
  2. Schalter thermostatisch gesteuert wärmende Decke ON und Band eine blauen Pad darüber.
  3. Das Beatmungsgerät Beatmungsgerät Schlauch zuordnen.
  4. Endotracheale Intubation Schlitten, Laryngoskop, lange pickup Pinzette, Stilett, Endotrachealtubus zu sammeln, und einem Wattestäbchen, getränkt mit 0,05 mL von 1 % Lidocain HCl. organisieren auf dem blauen Pad.
  5. Bestätigen Sie, dass Nagetier Narkose "bubble" Kammer, Ventilator, Luftkammer und Isofluran Kammer Schläuche sicher verbunden sind und an ihre jeweiligen Stecker oder Buchse angeschlossen. Die Narkose Blasenkammer Klemme sollte offen sein; die Ventilator-Klemme sollte geschlossen werden.
  6. Stellen Sie auf die Luftkammer der Drehknopf für die Raumluft auf 2 L/min und den Knopf für Sauerstoff, 1 L/min ein
  7. Schalten Sie die Isoflurane und stellen Sie die Regler auf 4 % des Volumens Mischung.
  8. Einen Timer gestartet und ein junger Erwachsener (≈3 Monate alt), männliche Sprague-Dawley Ratten (350 – 400 g) in Narkose Blasenkammer für 4 – 6 Minuten.
  9. Wiegen Sie Ratte an der 2 min-Marke.
  10. Bestätigen Sie, dass die Ratte durch sanft kneifen Hinterpfote Zehen vollständig betäubt ist. Wenn keine Pfote Rückzug beobachtet wird, reduzieren die Raumluft und Rändelknopf, 1 L/min, bis 0,4 L/min Sauerstoff und Isofluran auf 2 % des Volumens Mischung.
  11. Rektale Telethermometer Temperaturwächter schalten.
  12. Öffnen Sie die Halterung an den Ventilator und schließen Sie die Klemme, die Narkose Blasenkammer.
  13. Entfernen Sie Ratte aus Narkose Blasenkammer und Position auf Endotracheale Intubation Schlitten.
  14. Intubation Ratte. Laryngoskop in Tier das Maul, Pinzette lange pickup um die Zunge aus dem Weg, positionieren Tupfer Lidocain-getränkten Tupfer Wattetupfer entlang in die Kehle und sanft Mandrin mit den Endotrachealtubus in Ratte Luftröhre einfügen.
  15. Sobald intubiert, stecken Sie das Ende des Schlauches Ventilator bis zum äußeren Ende des Endotrachealtubus und beobachten Sie und überprüfen Sie, ob die Ratte stetig und ohne Schwierigkeit Atmung ist.
  16. Binden Sie den Endotrachealtubus in Ort darauf achten, dass die Zunge aus dem Knoten frei ist.
  17. Wenden Sie weiße Vaseline auf Telethermometer rektale Sonde an, und fügen Sie direkt unter der Rute.
  18. Das ABS Probentablett aus der Probenkammer und unter der Wärmelampe für die Erwärmung vor der Ratte Platzierung auf Tablett.
  19. Rasieren Sie oben auf die Ratte Kopfhaut angefangen über den Augen nach unten zwischen den Ohren.
  20. Schneiden Sie eine Standardgröße Schaumstoff Ohrstöpsel in identischen Hälften mit einer Schere. Starten Sie in der Mitte der Basis des Steckers und geradewegs auf die abgerundete Spitze schneiden. Legen Sie eine halbierte Stück in jeder Ohrstöpsel zuerst entlang dem Gehörgang bis Kontakt mit dem Trommelfell gemacht wird.
  21. Überwachen Sie rektale Temperatur. Sobald eine Temperatur von 37 ° C erreicht ist, kann die Ratte in das ABS Probentablett geladen werden.
  22. Sichern Sie die Ratte auf das ABS Probentablett. Entfernen Sie den Ventilator Schlauch aus den Endotrachealtubus und schieben Sie schnell, aber leise die Ratte in das obere Ende des Fachs, führen sanft den Kopf durch den Kopf Halter öffnen und Gummiring. Einzusetzen, die den Ventilator Schlauch zurück in den Endotrachealtubus, überprüfen Sie den Gummiring, stellen Sie sicher, es ist sicher, aber nicht eng um den Hals und stellen Sie sicher, dass die Ratte in eine seitliche Bauchlage (Abbildung 3 Verlegung ist).
  23. Schalten Sie die Isoflurane und entfernen Sie den Ventilator Schlauch vom endotracheal Schlauch.
  24. Sperren und das ABS Probentablett mit narkotisierten Ratte in der Probenkammer ABS zu sichern.
  25. Sanft Prise Hind Pfote Zehen lange Pinzette alle 3 s bis eine Rücknahme reflex-Reaktion ausgelöst wird.

(2) ABS Blast Gerät Vorbereitung und Blast-TBI Induktion

Hinweis: Protokoll-Schritte 2.1-2.10 sind in der Regel zur gleichen Zeit als Schritte 1.1 – 1.22 abgeschlossen, so dass das ABS für Blast Verletzungen Verwaltung Recht bereit ist, nachdem die Ratte ist geladen und in der Probenkammer gesichert.

  1. Lösen Sie den hydraulischen Hand Pumpe (Abb. 4A) Knopf um passives eingeschlossene Luft zu entkommen, die Treiber-Kammer (Abbildung 4B) und die Kammer aus seiner Dichtung lockern zu ermöglichen.
  2. Lockern Sie die Hutmuttern (Abb. 4C) aus der All-Thread Stäbe (Abbildung 4D) rund um die Fahrer-Kammer und der Kammers auf der linken Seite und Weg von der Expansionskammer (Abbildung 4E).
  3. Die beiden All-Gewinde-Stangen und ihre entsprechenden Hutmutter befindet sich an der Spitze der Fahrer Kammer um Platzierung der Mylar Bögen zwischen den Fahrer ermöglichen und Expansionskammer vollständig zu entfernen.
  4. Stack und Band zusammen entlang der Oberkante vier Pre-Cut und Pre gemessen (30 cm Länge, 20 cm Breite, Dicke 0,004 Zoll) Mylar Sheets (bilden eine Mylar "Membran") mit einem 2,54 cm Stück Klebeband. Mit einem zweiten Stück Klebeband, Klebeband sicher die Oberkante der Mylar Membran an die Spitze der Expansionskammer und über der Mitte der Öffnung zwischen den Fahrer und den Ausbau Kammern (Abbildung 4F).
  5. Die Fahrer Kammer gegen die Mylar-Membran ersetzt die beiden All-Gewinde Stangen an der Spitze der Kammer und Hand festziehen aller Hutmutter rund um die Kammer zu sichern.
  6. Situieren Sie Zubehör Stahlblock gegen hydraulische Hand Block und Fahrer Pumpenkammer bis sicher passen.
  7. Ziehen Sie die hydraulische Hand-Pumpe-Knopf und überprüfen Sie, ob die Fahrer Kammer unter Druck mit Dichtheit bleibt durch die Beobachtung einer Konstantdruck-Schwellenwerts auf dem hydraulischen Messgerät.
  8. Öffnen Sie die Trigger-Erwerb-Datei, die ABS Explosion Gerät Druck Spuren auf dem ABS Explosion Gerät Computer aufzeichnet.
  9. Lösen Sie die Druckluftbehälter (Abb. 4G) Haupt-Knopf genug leicht öffnen die Atemwege.
  10. Hand-Hydraulikpumpe zu betreiben, bis die Manometer-Anzeige der rote Pfeil, der eine gewünschte Kammer Druckniveau von ≈5, 000 Psi erreicht.
  11. Sichern und position der narkotisierten Tieres auf das ABS Probentablett (Abbildung 4H) in eine seitliche Bauchlage (Abbildung 3) und verriegeln Sie das Probentablett ABS-Probenkammer (Abbildung 4ich).
  12. Eine Hirschkuh sanft Prise Pfote lange Pinzette alle 3 s bis eine Rücknahme reflex-Reaktion ausgelöst wird.
  13. Klicken Sie auf Start , auf der Seite der geöffneten Erwerb auf dem ABS Explosion Gerät Computer.
  14. Sobald das 'Acquisitioning'-Fenster auf dem Bildschirm erscheint, drücken Sie und halten Sie ABS Explosion Gerät Auslöser bis die Explosion erlischt, bersten die Mylar-Membran und Verwaltung der ABS Blast Verletzungen (20,9 Psi ±1.14, 138 kPa ±7.9), die Ratte. Direkt nach die Explosion detoniert, starten Sie einen zweiten Timer um nachzuverfolgen, wie viel Zeit (in min und s) posttraumatischen verstrichen ist.
  15. Entfernen Sie die Ratte aus der ABS Probentablett und Rückkehr zur blauen Pad und wärmende Decke, platzieren ihn vollständig auf seinem Rücken zur Beurteilung der aufrichtenden reflex Unterdrückung.
  16. Notieren Sie die Zeit für die Rückkehr der aufrichtenden Reflex. Den zweite Timer, Dokument in min und s die Länge der Zeit nach der Verletzung dauert es für die Ratte vom Rücken auf den Bauch drei Rollen aufeinander folgenden Mal beobachten. Die Ratte, die Narkose Blasenkammer zurück.
  17. Lösen Sie den hydraulische Hand-Pumpe-Knopf um Treiber Kammer Lockerung und Bewegung ermöglichen.
  18. Ziehen Sie die Druckluftbehälter Haupt-Knopf um die Atemwege zu schließen.

Figure 3
Abbildung 3 : Ratte Platzierung auf ABS Probentablett und innen ABS. Richtung und Ausrichtung des Tieres innerhalb der ABS Studie. Wenn in der ABS platziert, ist das Tier in ein quer liegender Stellung mit der dorsalen Oberfläche des Kopfes senkrecht zur Stoßwelle (rote Pfeile). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Advanced Blast Simulator (ABS) Stoßsicherung Rohr schematische. Hauptkomponenten des ABS. A = Hand-Hydraulikpumpe; B = Fahrer Kammer; C = Hutmutter; D = All-Gewinde Stangen;  E = Expansionskammer; F = Speicherort der Mylar Membran Platzierung; G = Druckluftkartuschen; H = Probentablett; Ich = Probenkammer.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

3. Vorbereitung der Nager MCA PSS Lösung

Hinweis: Protokolls Schritte 3.1-3.3 sind in der Regel gleichzeitig durchgeführt, da Schritte 1.1 – 1.22 die PSS Lösung einsatzbereit ist.

  1. Zubereiten und mischen eine 1.000 mL physiologischer Kochsalzlösung (PSS) der folgenden Zusammensetzung und Konzentration: 130 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO4∙7H2O; 5 mM Glucose; 1,5 mM CaCl2; 15 mM Nahco33.
  2. Equilibrate PSS mit einem Gasgemisch von 21 % O2 und 5 % CO2 in ein ausgewogenes Verhältnis von N2. Die Lösung ist fertig, wenn der pH-Wert 7,4 liest.
    Hinweis: Von Druckgasflaschen in den oben genannten Konzentrationen sind alle Gase.
  3. Füllen Sie das Reservoir Flaschen und Schläuche mit vorbereiteten PSS-Lösung und die restliche Lösung chill.

4. Gewinnung von Nagetier MCA Segmente

  1. Kehren Sie nach dokumentieren die Zeitdauer der aufrichtenden reflex die Ratte zu der Narkose Blasenkammer. Schließen Sie die Klemme an den Ventilator, und öffnen Sie die Halterung an die Kammer. Drehen Sie Isofluran auf 4 % des Volumens Mischung und halten Sie die Ratte in der Kammer für 2 – 3 min. bis tief narkotisiert.
  2. Sobald die Ratte betäubt ist, öffnen Sie die Halterung an den Ventilator und schließen Sie die Klemme, die Narkose Blasenkammer. Reduzieren Sie der Isofluran auf 2 % des Volumens Mischung, und entfernen Sie ihn aus der Blasenkammer. Legen Sie ihn auf dem Bauch auf die wärmende Decke und Wiederanschließen Sie der Ventilator Schlauchende bis zum äußeren Ende des Endotrachealtubus.
  3. Beatmung mit einer Atem-Rate zwischen 40-45 Atemzüge / min. und Anästhesie bei 2 % Volumen Mischung entweder 30 oder 60 min zu erhalten sofort Post-bTBI Verletzungen.
  4. Nach Fertigstellung der entweder 30 oder 60 min Überlebenszeit, erhöhen die Isofluran auf 4 % des Volumens Mischung und tief betäuben für 5 – 6 min. sofort einschläfern Sie durch Enthauptung mit einem Nagetier-spezifische Guillotine.
    Hinweis: In diesen Experimenten haben wir die Tiere betäubt und mechanisch belüftet, nach der Rückkehr der aufrichtenden reflex bis Enthauptung.  Wenn die Studie längere überleben Zeitpunkten erforderlich ist, sollten Analgetika das Tier vor Entstehung aus der Narkose verabreicht werden.
  5. Entfernen Sie zart das Gehirn aus dem Schädel. Verwenden Sie eine #10 Skalpellklinge um eine zentrale, 1,5 Zoll vertikal, Knochen-Tiefe Einschnitt von der Spitze des rasierten Scalp hinunter die okzipitalen Kondylus zu machen.
  6. Verwenden Sie kleine Knochen Rongeurs zu öffnen und die Kopfhaut von dem Schädelknochen trennen.
  7. Verwenden Sie große Knochen Rongeurs zu senken und die okzipitalen, Interparietal und untere Hälfte der Stirnbeine umschließt das Gehirn zu extrahieren.
  8. Mit einem Spatel chirurgische vorsichtig auszugraben das Gehirn aus dem Schädel, sobald das Gehirn umgebenden Knochen ist.
    Hinweis: Nehmen Sie vorsichtig, wenn trennt das Gehirn aus dem Schädel so wie um nicht unnötig zu zerren, Ruck oder ziehen Sie die zarten MCA Wandabstand kranialen Segmenten.
  9. Zahlen Sie die geerntete Gehirn auf die gekühlte PSS-Lösung enthalten in einem kleinen Glas Petrischale, die direkt auf eine solide Eisblock ruht ein.
  10. Entfernen Sie vorsichtig sowohl links und rechts MCA Anfang im Kreis von Willis. Entfernen das Segment seitlich und dorsal für ca. 4 – 5 mm weiter.
  11. Reinigen Sie sanft gesammelt MCA-Segmente von ca. 4 – 5 mm in der Länge jedes Bindegewebe mit Mikrozangen.
  12. Montieren Sie die MCA auf dem Arteriograph. Cannulate das proximale Ende jedes Segments mit dem ersten Glas Mikropipette (Durchmesser ≈70 µm) und mit einer 10-0-Nylon-Naht zu sichern.
  13. Leise durchspülen der Lumina mit PSS, verbleibende Blut und andere Inhalte aus dem Lumen zu entfernen.
  14. Cannulate das distale Ende jedes Segments mit der zweiten Mikropipette ohne Dehnung der MCA-Segment und mit einer 10-0-Nylon-Naht zu sichern.
  15. Legen Sie nach der erfolgreichen Montage des Segments MCA die Kammer auf einem inversen Mikroskop Bühne für Vergrößerung der Gefäße. Das Mikroskop verfügt über eine Video-Kamera, Monitor und einen video Scaler mit eine optische Mikrometer für arterielle Durchmesser Messungen kalibriert.
  16. Füllen Sie jedes Segment und die umliegenden Arteriograph Bad mit kontinuierlich verbreitet PSS von Raumtemperatur auf 37 ° C erwärmt und mit dem Gasgemisch von 21 % O2 und 5 % CO2 in ein ausgewogenes Verhältnis von N2equilibriert.
  17. Equilibrate die MCA-Segmente mit einem Druck von 50 MmHg für 60 min durch die Erhöhung der Stausee Flaschen Mikropipetten zu einer entsprechenden Höhe über die Segmente verbunden. Druckaufnehmer befindet sich zwischen den Mikropipetten und Reservoir Flaschen prüft Transmural Druck innerhalb des MCA-Segments, die angibt, wann der gewünschte 50 MmHg Druck erreicht wird.
  18. Erhöhen Sie nach dem Abschluss der Periode Gleichgewichtherstellung den intravaskulären Druck bis 100 MmHg durch Festlegen der Behälter-Flaschen in verschiedenen Höhen.
  19. 30 mM K+ (zur Bestätigung des Schiffes Kontraktion) liefern über die luminalen Perfusat und arteriellen Durchmesser messen. Ca. 10 min später liefern 10-5 M Ach (für Gefäß Dilatation) und arteriellen Durchmesser messen.
  20. Schiff zögerliche Antworten zu prüfen. Senken Sie die Behälter Flaschen zu den intravaskulären Druck von 100 MmHg auf 80 MmHg zu senken. Die MCA-Segmente für 10 min. Maß arterielle Durchmesser equilibrate zu ermöglichen.
  21. Reduzieren Sie den intravaskulären Druck von 80 MmHg auf 60 MmHg. Die MCA-Segmente für 10 min. Maß arterielle Durchmesser equilibrate zu ermöglichen.
  22. Reduzieren Sie den intravaskulären Druck von 60 MmHg, 40 MmHg. Die MCA-Segmente für 10 min. Maß arterielle Durchmesser equilibrate zu ermöglichen.
  23. Reduzieren Sie den intravaskulären Druck von 40 MmHg auf 20 MmHg. Die MCA-Segmente für 10 min. Maß arterielle Durchmesser equilibrate zu ermöglichen.

Representative Results

Mittlere bTBI Überdruck für alle Studie Tiere war 20,9 Psi ±1.14 (138 kPa ±7.9). Die mittlere Dauer der aufrichtenden Reflex (RR) Unterdrückung für Ratten ausgesetzt ABS bTBI Shockwave Exposition (5,37 min ±2.1) war nicht signifikant länger (p = 0,36, bTBI vs. Sham) als in der Sham-Gruppe (5,10 min ±1.6).

In beiden 30 und 60 min. Sham Gruppen MCA Durchmesser erhöht über dem Ausgangswert Intraluminal Druck von 100 auf 20 MmHg reduziert wurde. Im Vergleich zu ihren entsprechenden Schein-Gruppen, die MCA zögerliche Antworten auf die kontinuierliche verhängt intravaskulären Druckabbau in der beobachteten 30 min (p = 0,01, bTBI vs. Schein) und 60 min (p = 0,02, bTBI vs. Sham) ABS bTBI Gruppen waren nach der Explosion Exposition (Abbildung 5) deutlich reduziert. Eine ausführlichere Diskussion dieser Ergebnisse finden Sie unter Rodriguez Et Al.39.

Diese Studien gezeigt, dass milde bTBI zerebrale kompensatorische Dilatator Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck in MCA Segmenten erheblich beeinträchtigt Laufzeiten von 30-60 min nach milden bTBI während der milden Schockwelle Ebenen verwendet in diesen Studien führte Unterdrückung der RR (< 30 s) ähnlich denen in Sham verletzt Ratten.

Statistische Analysen wurden mit der Software durchgeführt. Die myogen Reaktion auf Veränderungen im intravaskulären Druck wurde durch Berechnung der prozentuale Veränderung gegenüber dem Ausgangswert (100 MmHg) für jede Stufe der Intraluminal Druck (80, 60, 40 und 20 MmHg) beurteilt. Ungepaarte Student t-Test wurden verwendet, um Unterschiede zwischen den bTBI und Sham-Gruppe Grundlinien zu bewerten. Unterschiede im MCA Dilatator Antworten bTBI und Sham wurden anhand einer wiederholten Einweg Varianzanalyse (ANOVA) Dunnett mehrere Vergleiche und eine Bartlett Test für gleicher Varianz.

Aufgrund der Reduzierung statistische Aussagekraft, die aus wiederholten Tests, Vergleiche auf jeder bestimmten Druckpunkt in der MCA Experimente (z.B., zwischen 100 und 80 MmHg oder zwischen 60 und 40 MmHg, etc.) wurden nicht durchgeführt. Bedeutung nahm bei p ≤ 0,05 Niveau. Alle Daten in den Text, referenzierte Tabelle und Abbildung wird ausgedrückt bedeutet ± Standardfehler der Mittel (SEM).

Figure 5
Abbildung 5 : Auswirkungen von bTBI auf mittleren zerebralen arteriellen (MCA) Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck. Dilatator Antworten zu einer progressiven Reduzierung intravaskulären Druck beeinträchtigte gefäßerweiternde Antworten ausgestellt und wurden in den 30 min signifikant reduziert (p = 0,01, bTBI vs. Schein) und 60 min (p = 0,02, bTBI vs. Sham) bTBI Gruppen (n = 6/Gruppe) nach der Explosion Exposition gegenüber beiden Sham-Gruppen (n = 12). In beiden 30 und 60 min. Sham Gruppen MCA Durchmesser erhöht über dem Ausgangswert Intraluminal Druck von 100 auf 20 MmHg reduziert wurde. Werte werden dargestellt als Mittel ± SEM. *p < 0,05 vs. Schein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Wie bei allen Protokollen und Anweisungen, ist es zwingend erforderlich, dass bestimmte Schritte für das Protokoll in dieser bestimmten Studie möglichst genau eingehalten werden und so genau wie möglich. Nach der anfänglichen Intubation der Ratte ist es zu bestätigen, dass es stetig und ohne Schwierigkeit Atmung ist wichtig. Irrtümlich Einfügen der endotrachealen Schlauch in die Speiseröhre anstelle der Luftröhre führt zu raspeln, schwere Atmen, Blutungen und die anschließende mitreißend der Ratte durch mangelhafte Narkose Lieferung zu den Lungen.

Wenn die Mylar-Membran-Blätter über der Mitte der Öffnung zwischen dem Fahrer und den Ausbau Kammer taping, ist es unerlässlich, dass die Blätter zentriert sind und decken die gesamte Öffnung39,41. Szenario der Blätter über der Öffnung führt Luftverlust von der Fahrer-Kammer, ein Tropfen auf den erforderlichen Druck Membran Burst-Potenzial und Denial-of-Verwaltung der Explosion Verletzung. Richtig Situierung und sicher Montage Zubehör Stahlblock gegen Hand-Hydraulikpumpe Block und Fahrer Kammer ist auch wichtig, da die hydraulische Hand-Pumpe-Knopf anziehen ist und bestätigt der Fahrer Kammer bleibt unter Druck ohne Lecks. Die richtige Platzierung des Stahlblocks ermöglicht der Treiber Kammer fest gegen die Expansionskammer, wodurch die obligatorische Dichtung erforderlich, über die Öffnung durch die Mylar-Membran-Blätter und zwischen Fahrer und Ausbau Kammer Kammer zu schließen.

Während der Vorbereitungen vor der MCA-Schiff-Extraktionen, Begasung der PSS mit der nötigen Mischung aus 21 % O2 und 5 % CO2 in ein ausgewogenes Verhältnis von N2 gestalten die Lösung und erleichtert die machte pH-neutralen physiologischen Bedarf für eine PSS Lösung21,33,34arbeiten.

Äquilibrierung der Segmente bei konstantem Druck für 60 min.21,32,33,34 ist extrem obligatorisch, da dieser Schritt die Segmente ermöglicht um Folgendes zu verengen, was, denen eine maximale Ausdehnung während angezeigt Ihre ersten primären Druckbeaufschlagung. Dieses Ereignis zeigt das Auftreten von spontanen Ton, eine Eigenschaft, die für eine gesunde Arterie32,33,34. Obwohl verschiedene Druckstufen für Segment Gleichgewichtherstellung sein, in anderen Studien33,34,42, diese Studie und die von Mathew verwendet worden Et Al.21, Golding Et Al.35 und Golding Et Al.43 equilibriert die Segmente auf 50 MmHg. Während Äquilibrierung gesammelt Segmente irgendwo zwischen 40 MmHg – 100 MmHg32 ermöglicht Flexibilität und Modifikation für diesen Schritt des Protokolls, ein Zeitraum von Stunden Gleichgewichtherstellung innerhalb dieser Parameter Druck letztendlich gesunde bestätigt Arterien, die für die Fortsetzung des Experiments benötigt.

Bedacht zu nehmen, wenn das Gehirn aus dem Schädel und der linken und rechten MCA Segmente aus dem Kreis von Willis zu entfernen, während die Schiffe intakt zu halten, ist vielleicht der wichtigste Schritt das gesamte Protokoll. Punktion des Gehirns mit den Knochen Rongeurs, führt reißen oder schwere Dehnung der Segmente bei der Entnahme oder versehentlich ziehen die Schiffe mit dem chirurgischen Spatel, wenn das Gehirn aus dem Schädel Aushub letztlich Zerstörung der geernteten MCA, verursacht unbrauchbarer Segmente und eingestellt Verwendung dieser Reihe von Arterien, letztlich das gesamte Experiment für das Tier zu stornieren.

Wenn zerebrale vaskuläre Reaktionen auf aufschiebende oder constrictory Reize im MCA Segmente ex Vivo Messung nach dem Aufprall gesammelt oder Explosion TBI in-vivo hat Erfolg gebracht, ist die Methode nicht ohne seine Schwierigkeiten und/oder Einschränkungen. Vielleicht ist eines der mehr erkennbaren Komplexität im Zusammenhang mit der Untersuchung der Folgen der TBI auf die Zirkulation des zerebralen Gefäßsystems trennen die explizite Auswirkungen der TBI auf den Schiffen aus der impliziten Effekte entstehen durch die verschiedenen Materialien und Elemente durch das geschädigte Gehirn44erzeugt. Diese denkbar Ratlosigkeit kann möglicherweise umgangen werden, durch die Analyse ex Vivo die vasoconstrictory und gefäßerweiternde Reaktionen der geerntet, durchblutet und/oder MCA mit Druck beaufschlagt. In dem Bemühen, die Dauer der Zeit reduzieren, die Hirnarterien in-vivo vor Ort entladen parenchymatösen vasoaktive Material vor dem Tod ausgesetzt sind, kann Sammlung der Hirnarterien direkt nach TBI die so verlängert-Belastung vermindern Effekte. Ex-Vivo-Studien an isolierten MCA zusätzlich präsentieren Sie die Aussicht auf eine Analyse der Mechanismen der traumatischen Gefäßverletzung durch den Einsatz von bestimmten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten oder angeblichen Fahrzeuge der Gefäßverletzung, die Prüfung als nicht leisten würde effizient oder als diskriminierend in Vivo. Anschließend kann diese ex-Vivo-Methode mit ex-Vivo Exposition gegenüber Drogen, daraus resultierende myogen Antworten (Vasokonstriktion oder Dilatation der Schiff-Segment durch intravaskulären oder extravascular Arzneimittelexposition) testen kombiniert werden.

Andere Einschränkungen umfassen etwa oder ungeduldig entfernen der MCA aus dem geernteten Gehirn die vorzeitige reißen der Gefäße, so stornieren ihre Verwendung führen kann. Darüber hinaus kann mehr als ein paar Minuten zwischen Euthanasie des Tieres verstreichen zu lassen, Sammlung der Schiffe und ihrer Platzierung in der vorbereiteten PSS-Lösung auch ihre Lebensfähigkeit zunichte machen. Wenn richtig durchgeführt und folgte, können die Methoden beschrieben, die in diesem Protokoll zu Testzwecken myogen Antworten der MCA nach bTBI mehrere Stunden von Anfang dauert bis Ende und Versuche einer Einschränkung der Länge der Zeitaufwand für den Erfolg im experimentellen führen. Fehler. Allerdings ist diese Methode getan in-vitro- und nutzt deutlich mehr kostengünstige Instrumentierung und Ausrüstung als in-vivo hochauflösende Magnetresonanztomographie (MR) Bildgebung45,46 oder konventionellen Doppler-Sonographie / velocimetric Techniken47,48,49 die auch für Schiff Studien eingesetzt werden.

Diese Ergebnisse, dass milde bTBI Verletzung beeinträchtigt zerebralen dilatorisch Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck zugeordnet ist könnte möglicherweise eine Funktion des Vasospasmus6,7 und VSMC Hyperconstriction50 zuvor berichtete nach Explosion letztlich zu Ereignissen wie z. B. relative zerebrale Durchblutung reduziert. Darüber hinaus könnte Blast-induzierten Schäden behindern normale dilatorisch Reaktionen des zerebralen Gefäßsystems möglicherweise weiter Rückgang der zerebralen Perfusion in Kombination mit arterielle Hypotonie, eine häufige Inzidenz während der Kampfhandlungen fördern.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser bTBI ergibt sich eine Änderung auf die Mechanismen erleichtert die arteriellen Gefäßerkrankungen Kontrolle. Obwohl akute-Phase zerebrale vaskuläre Beeinträchtigung der arteriellen myogen Antwort zu einem Rückgang der intravaskulären Druck für mindestens eine Stunde nach der Verletzung beobachtet wurden, noch gibt es Lücken in den Informationen im Zusammenhang mit der akuten Phase nach bTBI. Die Bedeutung der Identifizierung, welche körperlichen und biochemischen Mängel Verletzungen der zerebralen Vasculature und der Gehirn-Exposition gegenüber bTBI, die Ursachen helfen konnte, bei der Festlegung der therapeutische bzw. rehabilitative Erfolg ziemlich sofort nach der Verletzung.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Studien wurden als Teil eines Teams, unterstützt durch das Moody-Projekt für Translationale traumatische Verletzungen Hirnforschung und W81XWH-08-2-0132 Award von der U.S. Army Medical Research und Material-Befehl - Department of Defense abgeschlossen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Blast Simulator (ABS) Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. N/A Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries 
Adult, male, Sprague-Dawley rats  Charles River Laboratories N/A Experimental animals
Arteriograph Living Systems Instrumentation, Inc. Arteriograph Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter 
Bone rongeurs, large FST Fine Science Tools Friedman Rongeur Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small FST Fine Science Tools Boynton Rongeur Brain extraction from skull
CaCl2  Sigma Calcium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs 3M Foam Ear Plugs 1100 Class AL  Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine 
Glucose Sigma D-[+]-Glucose Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane  Piramal Enterprises Limited  Isoflurane, USP Anesthetic
KCl Sigma Potassium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO4•7H2O  Sigma Magnesium sulfate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps Buxton Biomedical Inc. Micro Tying Fcps, 180mm Brain extraction from skull
Mylar sheets Texas Art Supply Mylar Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl Sigma Sodium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO3 Sigma Sodium bicarbonate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture Ethicon 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter      
Scalpel blade #10 Bard-Parker 10 Stainless Steel Surgical Blade Brain extraction from skull
Surgical spatula Delmaks Surgico Cement Spatula  Brain extraction from skull
Thermometer  Physitemp Instruments, Inc.,  Thermalert Monitoring Thermometer Monitoring of experimental animal's core body temperature 
Volume ventilator  Harvard Apparatus, Inc. Small Animal Ventilator Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket Gaymar Industries, Inc.  Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad Maintenance of experimental animal's body temperature 

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Neurowissenschaften Ausgabe 146 TBI Blast-induzierte Schädel-Hirn Verletzungen (bTBI) Blast-induzierte Neurotrauma primäre Blast Verletzungen zerebrale vaskuläre Reaktivität mittleren zerebralen Arterien (MCA) myogen Antwort
Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien
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Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).

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