Summary
Qui, presentiamo un protocollo per descrivere i metodi per ex vivo determinazione di reattività vascolare segue una ferita di cervello traumatica esplosione primaria (bTBI) utilizzando segmenti di isolato, pressurizzato, roditore arterioso cerebrale centrale (MCA). bTBI induzione avviene utilizzando un tubo d'urto, noto anche come un dispositivo avanzato simulatore di Blast (ABS).
Abstract
Anche se ci sono stati studi sugli effetti istopatologici e comportamentali dell'esposizione di scoppio, meno sono state dedicate agli effetti vascolari cerebrali di esplosione. Impatto (cioè, non-esplosione) trauma cranico (TBI) è noto per diminuire pressione autoregolamento nel vasculature cerebrale in sia in esseri umani ed in animali da esperimento. L'ipotesi che la ferita di cervello traumatica blast-indotta (bTBI), come impatto TBI, risultati nella reattività vascolare cerebrale alterata è stata testata misurando le risposte myogenic dilatorie a ridotta pressione intravascolare in roditore arterioso cerebrale centrale (MCA) segmenti da ratti sottoposti a lieve bTBI utilizzando un tubo di shock Blast simulatore avanzato (ABS). Adulti, maschi ratti Sprague-Dawley erano anestetizzati, intubati, ventilati e preparati per bTBI Sham (manipolazione identici e anestesia fatta eccezione per la ferita di scoppio) o lieve bTBI. Ratti sono stati assegnati a caso per ricevere Sham bTBI o lieve bTBI seguita da sacrificio 30 o 60 min post-infortunio. Subito dopo bTBI, raddrizzante volte riflesse di soppressione (RR) sono stati valutati, eutanasia presso i punti di tempo post-lesione è stata completata, il cervello è stato raccolto e i singoli segmenti MCA sono stati raccolti, montati e pressurizzati. Come la pressione intraluminal irrorata attraverso i segmenti arteriosi è stata ridotta a 20 mmHg con incrementi da 100 a 20 mmHg, MCA diametri erano misurati e registrati. Con la diminuzione della pressione intraluminal, MCA diametri costantemente aumentati significativamente di sopra della linea di base nei gruppi Sham bTBI mentre le risposte del dilatatore MCA sono stati ridotti significativamente (p < 0,05) in entrambi i gruppi bTBI come testimoniano i vedenti, più piccolo Diametri MCA registrato per i gruppi di bTBI. Inoltre, la soppressione di RR nei gruppi bTBI era significativamente (p < 0,05) superiore nei gruppi bTBI Sham. MCA di raccolti dalla bTBI di Sham gruppi proprietà vasodilatatrici tipici esposti alle diminuzioni nella pressione intraluminal mentre MCA raccolti a seguito di bTBI hanno esibito significativamente alterata risposte myogenic vasodilatatori ridotta pressione che ha persistito per almeno 60 min dopo bTBI.
Introduction
Simile a quello risultante dall'impatto (cioè, non-esplosione) TBI, ferita di cervello traumatica blast-indotta (bTBI) è stata associata con danno vascolare cerebrale1 e alterato le risposte compensative vascolare cerebrale alle occorrenze come alterazioni delle pressioni parziali di anidride carbonica (PaCO2)2,3,4 e ossigeno (PaO2)5. Inoltre, l'esposizione di scoppio ha causato il vasospasmo arterioso cerebrale in animali6 e bTBI pazienti7,8. Mentre clinico TBI9 e lesioni fluido-percussioni (FPI)10,11,12 sono associati con le risposte vascolari cerebrali alterate ai cambiamenti nella pressione sanguigna arteriosa (cioè, pressione di autoregolazione)9,10,11,12, permangono incertezze per quanto riguarda gli effetti del bTBI sulla capacità di autoregolazione pressione vascolare cerebrale.
La circolazione cerebrale reagisce alle variazioni di pressione arteriosa sistemica con l'intento di mantenere un continuo di ossigeno e apporto di sostanze nutritive consegnata al cervello metabolicamente attivo13,14,15, 16. Un tipo unico di omeostasi, autoregolamento17,18,19 si verifica quando "un organo mantiene un flusso costante di sangue malgrado i cambiamenti nella pressione sanguigna (aspersione) o da altri stimoli fisiologici o patologici" 20. arterie cerebrali si restringono o si dilatano in risposta a variazioni della pressione sanguigna, l'ossido nitrico (NO), viscosità del sangue, PaCO2 e PaO2, ecc.4,11,16, 21. valutazione della risposta miogenica arteriosa si riferisce a tali contrazioni o dilatazioni. La risposta vascolare miogenica, in primo luogo descritta da Bayliss22 e un meccanismo importante contribuendo alla autoregolamento di CBF, è caratterizzata da vasocostrizione se aumenta la pressione di aspersione e vasodilatazione se diminuisce la pressione di aspersione 14 , 17. questa risposta vascolare è la capacità intrinseca dei tessuti contrattili (ad esempio cellule di muscolo liscio vascolare, VSMC) di rispondere per allungare e/o cambiamenti nel lume e/o parete tensione23,24, 25,26,27,28,29. Quando le arterie sono tese (ad es., durante la pressione intravascolare aumenta), costrizione di VSMC24,25,26,28.
Studi che esaminano le navi di resistenza ex vivo sono comunemente impiegati uno dei due metodi per testare le proprietà farmacologiche e fisiologiche dei vasi di resistenza isolato: il metodo anello-montato e il cannulate, pressurizzato metodo. Il metodo di preparazione anello montato nave comporta due fili passati intraluminally attraverso il segmento di vaso, che tengono il segmento sul posto. Misurazione della quantità di forza applicata sui fili isometricamente sostenuti calibri la stimolazione delle VSMC. Tuttavia, questa tecnica porta con sé alcune riserve, in particolare, le inevitabili danni sorretto dallo strato endoteliale del lume come i fili vengono passati attraverso di essa30 e il variabile grado di stretching sostenuto dal segmento isolato che a sua volta conduce alla distensione di parete di vaso, in ultima analisi che interessano sensibilità dell'imbarcazione a agenti farmacologici31. La metodologia di preparazione cannulate, pressurizzato nave utilizza un arteriograph composto da due camere separate che ogni casa il posizionamento di un arterioso cerebrale centrale (MCA) raccolta da un singolo animale. Una micropipetta viene inserita in ogni estremità del segmento, l'estremità prossimale del segmento è fissato per la micropipetta con punti di sutura e il lume è dolcemente irrorato con una soluzione salina fisiologica (PSS) al fine di eliminare il sangue e altre sostanze. L'estremità distale è quindi garantito con punti di sutura. Transmurale o pressione luminal è impostato sollevando i due serbatoi collegati a ogni pipetta a un'altezza adeguata sopra ogni segmento, ma ad altezze diverse per quanto riguarda le altre32,33,34,35 ,36. Trasduttori di pressione posizionati lungo i bacini e Micropipette forniscono aspersione misure di pressione mentre vasi vengono ingranditi utilizzando un microscopio invertito provvisto di monitor, videocamera e scaler che permette di misurare dell'esterno Diametri MCA. Anche se entrambi i metodi sono preziosi, la metodologia di preparazione nave cannulate, pressurizzato imita meglio e permessi i vasi studiato per essere più vicini a loro in vivo condizioni32,37.
Gli effetti di diversi tipi di impatto (cioè, non-esplosione) TBI su risposte vascolari cerebrali precedentemente sono state studiate in segmenti arteriosi cerebrali21,35,36,38. Utilizzando un simile ex protocollo MCA vivo per vaso raccolta, montaggio e perfusione come descritto nello studio corrente, gli studi più iniziali ottengono successo con loro rispettive indagini i meccanismi associati di disfunzione del sistema vascolare cerebrale dopo TBI. Golding et al.34 ha esaminato le dilatazioni endoteliale mediata nel adulto, maschio lungo Evans ratto MCA seguito TBI severo attraverso lesioni impatto corticale controllato (CCI). In un secondo studio, Golding et al.36 studiato reattività cerebrovascolare a ipotensione o CO2 dopo la raccolta di MCA dai ratti che ha sostenuto una lieve CCI. Yu et al.38 analizzato se le risposte dilatorio migliorata di peroxynitrite spazzini alla ridotta pressione intravascolare in adulti, maschi Sprague-Dawley ratto MCA segmenti sottoposto a dei FPI Mathew et al.21 studiato le risposte myogenic a ipotensione in MCA di raccolte dopo moderato, FPI centrale.
Per meglio indagare l'ipotesi che bTBI, come non-blast TBI, risultati nella reattività vascolare cerebrale alterata, abbiamo testato un meccanismo contribuendo alla autoregolamento compromesso misurando le risposte myogenic dilatorie a ridotta pressione intravascolare ex vivo in isolato, pressurizzati roditore MCA segmenti (Figura 1) raccolti da ratti sottoposti a lieve bTBI utilizzando un modello di filmato shock Blast simulatore avanzato (ABS) (Figura 2 e Figura 3) (vedere Rodriguez et al.39 Tabella 1) che utilizza aria compressa erogata direttamente ad una camera driver per generare Freidlander-come40 sopra e sotto pressione onde (vedere Rodriguez et al.39Figura 1A).
Figura 1 : Posizione delle arterie cerebrali (MCA). Vista ventrale del cervello del ratto evidenziando la posizione del relativo le arterie cerebrali posteriori (PCA), arterie carotiche interne (ICA), arterie carotiche esterne (ECA), arteria basilare (BA) e le arterie carotiche comuni (CCA) di MCA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Avanzato dispositivo di tubo shock Blast Simulator (ABS). L'ABS è usato per produrre la ferita di scoppio primario in tutti gli animali di studio. 1 = camera driver; 2 = camera di espansione; 3 = camera di esemplare; 4 = soppressore onda riflessa; stella gialla = vassoio porta campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Texas Medical Branch, un'associazione per la valutazione e accreditamento di cura degli animali di laboratorio (AAALAC) accreditato presso la struttura.
1. animale preparazione per ferita di scoppio di ABS
- Accendere il ventilatore volume roditore meccanico e impostare velocità di respiro tra i 40 – 45 respiri al minuto.
- Interruttore termostaticamente controllato riscaldamento coperta ON e nastro un pad blu su di esso.
- Collegare il tubo del ventilatore al ventilatore.
- Si riuniscono a slitta l'intubazione endotracheale, laringoscopio, pinzette lungo ritiro, mandrino, tubo endotracheale, e un batuffolo di cotone imbevuto con 0,05 mL di 1% lidocaina HCl. organizza il riquadro blu.
- Confermare che roditore anestetico "bubble" camera, ventilatore, camera d'aria e isoflurano alloggiamento tubi siano correttamente collegati e collegati al loro rispettivo spina o la presa. Il morsetto di anestetico alloggiamento di bolla dovrebbe essere aperto; il morsetto del ventilatore deve essere chiuso.
- Sulla camera d'aria, posizionare la manopola per aria a 2 L/min e la manopola per ossigeno a 1 L/min.
- Accendere l'isoflurano e impostare la manopola al 4% di miscela di volume.
- Avviare un timer e inserire un giovane adulto (≈3 mesi), ratto Sprague-Dawley maschio (350-400 g) l'anestetica nella camera a bolle per 4 – 6 min.
- Pesare ratto al mark 2 min.
- Confermare il ratto è completamente anestetizzato pinzando delicatamente le dita dei piedi zampa posteriore. Se non si è osservato nessun ritiro di zampa, ridurre l'aria della stanza e impostare la manopola a 1 L/min, ossigeno a 0,4 L/min e isoflurano al 2% della miscela di volume.
- Accendere un teletermometro rettale temperatura monitor.
- Aprire il morsetto al ventilatore e chiudere il morsetto per l'alloggiamento di bolla anestetico.
- Rimuovere ratto da anestetico alloggiamento di bolla e posizione sulla slitta di intubazione endotracheale.
- Intubare ratto. Posizionare il laringoscopio in bocca dell'animale, utilizzare pinzette lungo ritiro per posizionare la lingua fuori mano, punta del tampone cotone imbevuto lidocaina tampone lungo all'interno della gola e inserire delicatamente il mandrino contenente il tubo endotracheale nella trachea di ratto.
- Una volta intubato, inserire l'estremità del tubo ventilatore per l'estremità esterna del tubo endotracheale e osservare e confermare che il ratto sta respirando costantemente e senza difficoltà.
- Legare il tubo endotracheale in posto avendo cura che la lingua è libera dal nodo.
- Applicare vaselina bianca per un teletermometro rettale sonda e inserire direttamente sotto la coda.
- Rimuovere il vassoio di campione ABS dalla camera di esemplare e posto sotto la lampada di calore per il riscaldamento prima del posizionamento del ratto sul vassoio.
- La parte superiore del cuoio capelluto del ratto a partire sopra gli occhi e giù per la barba tra le orecchie.
- Tagliate a metà identiche con le forbici una spina di orecchio di schiuma di dimensioni standard. Avviare al centro della base della spina e tagliare dritto fino la punta arrotondata. Inserire un pezzo dimezzato ogni punta dell'orecchio prima lungo il canale dell'orecchio fino a quando avviene il contatto con la membrana timpanica.
- Monitorare la temperatura rettale. Una volta raggiunta una temperatura di 37 ° C, il ratto è pronto per essere caricato nel vassoio di campione ABS.
- Fissare il ratto sul vassoio di campione ABS. Rimuovere il tubo del ventilatore dal tubo endotracheale e rapidamente ma dolcemente scivolare il ratto nell'estremità superiore del cassetto, guida delicatamente la testa attraverso l'apertura del supporto testa e colletto in gomma. Reinserire il tubo ventilatore nuovamente dentro il tubo endotracheale, controllare il collare di gomma per assicurarsi che sia saldamente ma non strettamente intorno al collo e verificare che il ratto è posa in posizione prona laterale (Figura 3).
- Spegnere l'isoflurano e rimuovere il tubo del ventilatore dal tubo endotracheale.
- Chiudere e fissare il vassoio di campione ABS contenente ratto anestetizzato nella camera del campione ABS.
- Delicatamente pizzico posteriore della zampa le dita dei piedi con pinzette lunghe ogni 3 s fino a quando una risposta riflessa di ritiro è suscitata.
2. preparazione del dispositivo ABS Blast e Blast-TBI induzione
Nota: Passaggi di protocollo 2.1 – 2,10 sono in genere completate allo stesso tempo come passi 1.1 – 1,22 così l'ABS è pronto per diritto di amministrazione di esplosione ferita dopo il ratto viene caricato e fissato nella camera del campione.
- Allentare la manopola di pompa (Figura 4A) idraulica manuale al fine di consentire qualsiasi residuo aria intrappolata a fuggire dalla camera driver (Figura 4B) e per allentare la camera dalla sua tenuta.
- Allentare i dadi di cappello (Figura 4C) dalle aste di tutti-filo (Figura 4D) che circonda la camera driver e far scorrere la camera a sinistra e dalla camera di espansione (Figura 4E).
- Rimuovere completamente le due aste di thread di tutti e loro corrispondenti dadi a cappello situati nella parte superiore della sezione driver al fine di consentire il posizionamento dei fogli mylar tra il driver e camera di espansione.
- Stack e nastro insieme lungo il bordo superiore quattro pre-taglio e pre-misurato (lunghezza 30 cm, larghezza 20 cm, 0,004 pollici spessi) fogli di mylar (formando una mylar ' membrana') utilizzando un pezzo di 2,54 cm di nastro adesivo. Utilizzando un secondo pezzo di nastro adesivo, nastro saldamente il bordo superiore della membrana mylar alla parte superiore della camera di espansione e sopra il centro dell'apertura tra le camere di driver e di espansione (Figura 4F).
- Fissare la camera driver contro la membrana di mylar sostituendo le due aste di tutti-filo nella parte superiore della sezione e stringendo a mano tutti i dadi di cappello che circonda la camera.
- Situare l'accessorio blocco d'acciaio contro la camera driver e blocco della pompa idraulica manuale fino a montare in modo sicuro.
- Serrare la manopola di pompa idraulica manuale e confermare che la camera driver rimane pressurizzata senza perdite osservando una soglia di pressione costante sul contatore idraulico.
- Aprire il file di acquisizione di trigger che registra tracce di pressione ABS blast dispositivo sul computer dispositivo ABS blast.
- Svitare (Figura 4G) manopola principale del serbatoio aria compressa abbastanza leggermente aprire le vie respiratorie.
- Azionare la pompa idraulica manuale fino a quando l'indicatore raggiunge la freccia rossa che indica un livello di pressione desiderato camera di ≈5, 000PSI.
- Garantire e posizionare l'animale anestetizzato sul vassoio campione ABS (Figura 4H) in posizione prona laterale (Figura 3) e bloccare il vassoio di campione nella camera di esemplare di ABS (Figura 4ho).
- Pizzicare delicatamente una posteriore della zampa con pinzette lunghe ogni 3 s fino a quando una risposta riflessa di ritiro è suscitata.
- Fare clic su Start nella pagina acquisizione aperto sul computer dispositivo ABS blast.
- Una volta che la finestra 'Per acquisizione sagoma' appare sullo schermo, premere e tenere premuto il grilletto di dispositivo ABS esplosione fino a quando l'esplosione si spegne, rottura della membrana di mylar e l'amministrazione della ferita di scoppio ABS (20,9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) al ratto. Subito dopo l'esplosione esplode, avviare un secondo timer per tenere traccia di quanto tempo (in min e s) ha trascorso post-infortunio.
- Rimuovere il ratto dal vassoio di campione ABS e tornare al pad blu e coperta riscaldante, ponendolo completamente sulla schiena per la valutazione di soppressione del riflesso di raddrizzamento.
- Registrare il tempo di ritorno del riflesso di raddrizzamento. Osservando il secondo timer, documento in min e s la lunghezza di tempo ci vuole per il ratto a rotolare dalla sua schiena sul suo stomaco tre successivo di alberino-ferita volte. Restituire il topo per l'alloggiamento di bolla anestetico.
- Allentare la manopola di pompa idraulica manuale al fine di consentire driver camera allentando e movimento.
- Serrare la manopola principale del serbatoio dell'aria compressa al fine di chiudere le vie respiratorie.
Figura 3 : Posizionamento del ratto sul vassoio campioni ABS e all'interno di ass. Direzione e l'orientamento dell'animale studio all'interno dell'ABS. Quando sono immessi in ABS, l'animale è in posizione prona trasversa con superficie dorsale della testa perpendicolare alla direzione di onde d'urto (frecce rosse). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Dispositivo di tubo di shock Blast simulatore avanzato (ABS) schematico. Principali componenti dell'ABS. A = pompa idraulica manuale; B = Camera driver; C = Dadi ciechi; D = tutti-filetto aste; E = camera di espansione; F = posizione di posizionamento della membrana di mylar; G = bombole di aria compressa; H = Vassoio campioni; Io = camera di esemplare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. preparazione della soluzione PSS roditore MCA
Nota: Passaggi di protocollo 3.1-3.3 sono in genere completati allo stesso tempo come passaggi 1.1 – 1.22 per avere la soluzione PSS è pronto per l'uso.
- Preparare e mescolare una soluzione salina fisiologica di 1.000 mL (PSS) di composizione le seguenti concentrazioni: 130 mM NaCl; 4.7 mM KCl; 1,17 mM MgSO4∙7H2O; glucosio 5 mM; 1,5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3.
- Equilibrare il PSS con una miscela di gas del 21% O2 e 5% CO2 in un equilibrio di N2. La soluzione è pronta quando legge il pH 7,4.
Nota: Tutti i gas sono ottenuti da bombole di gas compresso nelle concentrazioni sopra menzionate. - Riempire il serbatoio bottiglie e tubi con soluzione preparata di PSS e chill la soluzione rimanente.
4. estrazione di segmenti di roditore MCA
- Dopo aver documentato la lunghezza del tempo riflesso raddrizzante, restituire il topo per l'alloggiamento di bolla anestetico. CHIUDERE il morsetto al ventilatore e aprire il morsetto alla camera. Girare l'isoflurano al 4% di miscela di volume e il ratto nella camera per 2 – 3 minuti fino a quando non anestetizzati.
- Una volta che il ratto è anestetizzato, aprire il morsetto al ventilatore e chiudere il morsetto per l'alloggiamento di bolla anestetico. Ridurre l'isoflurano al 2% della miscela di volume e rimuovere da lui la camera a bolle. Lo posto sul suo stomaco sulla coperta riscaldante e re-inserire l'estremità del tubo ventilatore per l'estremità esterna del tubo endotracheale.
- Mantenere la ventilazione meccanica ad un tasso di respiro tra 40 – 45 respiri al minuto e anestesia al 2% della miscela di volume per 30 o 60 min immediatamente post-bTBI lesioni.
- Dopo completamento di entrambi i 30 o 60 min tempo di sopravvivenza, aumentare l'isoflurano al 4% di miscela di volume e profondamente anestetizzare per un minimo di 5 – 6 immediatamente eutanasia per decapitazione usando una ghigliottina di roditore-specifici.
Nota: In questi esperimenti, abbiamo mantenuto gli animali anestetizzati e ventilati meccanicamente dopo il ritorno di raddrizzamento riflessa fino alla decapitazione. Se lo studio richiede più punti temporali di sopravvivenza, è necessario somministrare analgesici all'animale prima emersione dall'anestesia. - Rimuovere delicatamente il cervello dal cranio. Utilizzare una lama per bisturi #10 per fare una centrale, incisione verticale, osso-profonda 1,5 pollici dalla parte superiore del cuoio capelluto rasato giù per il condilo occipitale.
- Utilizzare Pinze ossivore piccolo osso per aprire e separare la pelle del cuoio capelluto dall'osso del cranio.
- Utilizzare Pinze ossivore grande osso per tagliare ed estrarre l'occipitale, interparietal e metà inferiore delle ossa frontali che incassa il cervello.
- Utilizzare una spatola chirurgica a scavare con attenzione il cervello dal cranio, una volta che il cervello è libero dell'osso circostante.
Nota: Fare estrema attenzione quando che separa il cervello dal cranio così come per non tirare inutilmente, jerk o tirare la MCA delicata segmenti dalla parete cranica. - Depositare il cervello raccolto nella soluzione PSS refrigerata contenuta in un piccolo bicchiere di Petri che poggia direttamente sulla cima di un blocco di ghiaccio solido.
- Rimuovere con attenzione sia l'inizio di MCA di sinistra e destro al cerchio di Willis. Continuare a rimuovere il segmento lateralmente e dorsalmente per circa 4 – 5 mm.
- Pulire delicatamente i segmenti MCA raccolti di circa 4 – 5 mm di lunghezza di tessuto connettivo utilizzando Micropinze.
- Montare la MCA sulla arteriograph. Incannulare l'estremità prossimale di ogni segmento con il prima micropipetta di vetro (diametro ≈70 µm) e fissarlo con una sutura in nylon 10-0.
- Morbidamente irrorare il lumina con PSS per rimuovere eventuali residui di sangue e altri contenuti dal lume.
- Incannulare l'estremità distale di ogni segmento con la micropipetta seconda senza allungare il segmento MCA e fissarlo con una sutura in nylon 10-0.
- Dopo montaggio riuscito del segmento MCA, posizionare la camera in cima di fase di un microscopio invertito per l'ingrandimento dei vasi. Il microscopio è dotato di una videocamera, monitor e uno scaler video calibrato con un micrometro ottico per la misurazione del diametro arterioso.
- Riempire ogni segmento e il bagno arteriograph circostante con PSS continuamente circolata riscaldato da temperatura ambiente a 37 ° C ed equilibrato con la miscela di gas del 21% O2 e 5% CO2 in un equilibrio di N2.
- Equilibrare i segmenti MCA ad una pressione di 50 mmHg per 60 min alzando le bottiglie di serbatoio collegate alle Micropipette ad un'altezza adeguata sopra i segmenti. Trasduttori di pressione che si trova tra le micropipette e serbatoio bottiglie valuterà pressione transmurale all'interno del segmento MCA che indica quando viene raggiunta la pressione desiderata 50 mmHg.
- Dopo la conclusione del periodo di equilibrazione, aumentare la pressione intravascolare a 100 mmHg impostando le bottiglie di serbatoio a diverse altezze.
- Consegnare 30 mM K+ (per la conferma della contrazione del vaso) tramite il perfusato luminal e misura diametri arteriosi. Circa 10 minuti più tardi consegnare 10-5 M Ach (per la dilatazione del vaso) e misurare i diametri arteriosi.
- Esaminare la nave dilatorio risposte. Abbassare le bottiglie di serbatoio per ridurre la pressione intravascolare da 100 mmHg a 80 mmHg. Consentire i segmenti MCA equilibrare per diametri arteriosi misura di 10 min.
- Ridurre la pressione intravascolare 80 mmHg a 60 mmHg. Consentire i segmenti MCA equilibrare per diametri arteriosi misura di 10 min.
- Ridurre la pressione intravascolare da 60 mmHg a 40 mmHg. Consentire i segmenti MCA equilibrare per diametri arteriosi misura di 10 min.
- Ridurre la pressione intravascolare da 40 mmHg a 20 mmHg. Consentire i segmenti MCA equilibrare per diametri arteriosi misura di 10 min.
Representative Results
Media bTBI sovrapressione per tutti gli animali di studio era 20,9 psi ±1.14 (138 kPa ±7.9). La durata media della soppressione di riflesso (RR) per i ratti sottoposti all'esposizione ABS bTBI shockwave (5,37 min ±2.1) di raddrizzamento non era significativamente più lunga (p = 0,36, bTBI vs sham) che nel gruppo finto (5,10 min ± 1,6).
In entrambi i 30 e 60 min sham gruppi, diametri MCA aumentato di sopra della linea di base come pressione intraluminal è stato ridotto da 100 a 20 mmHg. Rispetto ai gruppi di sham corrispondenti, le risposte dilatorie MCA per il continuo imposto riduzione di pressione intravascolare nel min 30 osservati (p = 0,01, bTBI vs sham) e 60 min (p = 0.02, bTBI vs sham) ABS bTBI gruppi erano ridotto significativamente dopo l'esposizione di scoppio (Figura 5). Per una discussione più dettagliata di questi risultati, vedere Rodriguez et al.39.
Questi studi hanno rivelato che bTBI mite ha alterato significativamente la risposte cerebrali dilatatore compensativi a ridotta pressione intravascolare in segmenti MCA 30 e 60 min dopo lieve bTBI mentre i livelli di lieve shock wave utilizzate in questi studi ha provocato le durate di soppressione di RR (< 30 s) simili a quelli in ratti sham-danneggiati.
Le analisi statistiche sono state eseguite con il software. La valutazione della risposta miogenica ai cambiamenti nella pressione intravascolare è stata valutata calcolando variazioni percentuali dal basale (100 mmHg) per ogni livello di pressione intraluminal (80, 60, 40 e 20 mmHg). T-test dello studente spaiato sono stati utilizzati per valutare le differenze tra le previsioni del gruppo bTBI e sham. Le differenze nelle risposte di dilatatore MCA tra gruppi bTBI e sham sono state valutate utilizzando test comparazioni multiple di Dunnett un unidirezionale ripetute analisi della varianza (ANOVA) e test di un Bartlett per uguale varianza.
A causa della riduzione nel potere statistico che i risultati dalle prove ripetute, i confronti in ogni punto di pressione specifico nel MCA esperimenti (ad esempio, tra 100 e 80 mmHg o tra 60 e 40 mmHg, ecc.) non sono stati condotti. Significato è stata accettata presso il p ≤ 0.05 livello. Tutti i dati in testo, tabella e la figura è espresso come mezzi ± errori standard dei mezzi (SEM).
Figura 5 : Effetti del bTBI sulle risposte arterioso cerebrale centrale (MCA) di riduzione della pressione intravascolare. Dilatatore risposte ad una progressive riduzione pressione intravascolare hanno esibito le risposte vasodilatatori alterate e sono stati ridotti significativamente in 30 min (p = 0,01, bTBI vs sham) e 60 min (p = 0.02, bTBI vs sham) bTBI gruppi (n = 6/gruppo) dopo l'esposizione di scoppio rispetto ad entrambi i gruppi Sham (n = 12). In entrambi i 30 e 60 min sham gruppi, diametri MCA aumentato di sopra della linea di base come pressione intraluminal è stato ridotto da 100 a 20 mmHg. I valori sono tracciati come mezzi ± SEM. *p < 0,05 contro sham. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Come con tutti i protocolli e le istruzioni, è indispensabile che alcuni passaggi per il protocollo in questo studio particolare sono seguiti nel modo più accurato e più precisamente possibile. Dopo l'intubazione iniziale del ratto è importante confermare che sta respirando costantemente e senza difficoltà. Erroneamente inserimento del tubo endotracheale nell'esofago invece la trachea si tradurrà in raspare, difficili respiri, sanguinamento e la successiva travolgente del ratto a causa della carente anestetico consegna ai polmoni.
Quando i fogli di membrana di mylar di nastratura sopra il centro dell'apertura tra la camera di driver e di espansione, è imperativo che i fogli sono centrati e coprono l'intera apertura39,41. Disallineati i fogli sopra l'apertura si tradurrà in perdite d'aria dalla camera di driver, una goccia nella pressione richiesta per scoppio-potenziale di membrana e la negazione dell'amministrazione della ferita di scoppio. Montaggio saldamente il blocco in acciaio accessorio e situare correttamente contro la pompa idraulica manuale camera di blocco e il driver è anche essenziale come sta stringendo la manopola di pompa idraulica manuale e confermando la camera driver rimane pressurizzato senza perdite. Corretto posizionamento del blocco d'acciaio permette la camera driver chiudere saldamente contro la camera di espansione, creando così il sigillo obbligatorio richiesto sopra la camera di apertura per i fogli di membrana di Mylar e tra la camera di driver e di espansione.
Durante i preparativi prima le estrazioni di vaso MCA, gassazione PSS con la miscela necessaria del 21% O2 e 5% CO2 in un equilibrio di N2 equilibra la soluzione e facilita il pH fisiologico neutro richiesto necessario per un lavorando PSS soluzione21,33,34.
Equilibrare i segmenti a pressione costante per 60 min21,32,33,34 è estremamente obbligatorio come questo passaggio permette i segmenti costrizione segue che una dilatazione massima visualizzata durante loro primo pressurizzazione primarie. Questo evento dimostra l'avvenimento di tono spontaneo, una proprietà indicativa di un'arteria sana32,33,34. Anche se i livelli di pressione assortiti di equilibramento di segmento sono stati utilizzati in altri studi33,34,42, questo studio e quelli di Mathew et al.21, Golding et al.35 e Golding et al.43 equilibrati i segmenti a 50 mmHg. Mentre vengono raccolti segmenti ovunque tra 40 mmHg – 100 mmHg32 consente alcune flessibilità e modifica per il passo del protocollo, un periodo di equilibrazione ore all'interno di quei parametri di pressione in definitiva conferma sano arterie necessarie per la continuazione dell'esperimento.
Prendendo estrema cautela quando si rimuove il cervello dal cranio e i segmenti MCA di sinistra e destro dal cerchio di Willis, mantenendo intatte quelle navi è forse la fase più critica del protocollo intero. Perforando il cervello con l'osso Pinze ossivore, strappo o stiramento grave dei segmenti durante la rimozione o accidentalmente tirando i vasi con la spatola chirurgica quando il cervello dal cranio di scavo si tradurrà in definitiva distruzione del raccolto MCA, causando segmenti inservibili e interrotto l'uso di tale sistema di arterie, in ultima analisi, invalidare l'intero esperimento per quell'animale.
Anche se le risposte vascolari cerebrali agli stimoli dilatori o constrictory in MCA segmenti ex vivo di misurazione raccolti dopo l'impatto o esplosione TBI in vivo ha dato il successo, la metodologia non è senza la sua difficoltà e/o limitazioni. Forse uno delle più percepibile complessità legata con esaminare le conseguenze di TBI sulla circolazione del vasculature cerebrale sta staccando gli effetti espliciti di TBI sui vasi dagli effetti impliciti sostenuti a causa di vari materiali e elementi generati dal cervello danneggiato44. Questa perplessità immaginabile può potenzialmente essere eluso analizzando ex vivo le reazioni vasoconstrictory e vasodilatatrice del raccolto, irrorati e/o pressurizzato di MCA. Nel tentativo di ridurre la durata del tempo che le arterie cerebrali in vivo sono esposti a scaricato localmente parenchimatico vasoattivo materiale prima della morte, la collezione delle arterie cerebrali direttamente dopo TBI può diminuire il grado di tale esposizione prolungata effetti. Ex vivo studi di MCA isolato inoltre presentare la prospettiva di analisi di meccanismi della ferita traumatica vascolare attraverso l'uso di agonisti del recettore particolare e antagonisti o veicoli reputati di lesione vascolare che non potrebbe permettersi controllo come in modo efficiente o come discriminatorio in vivo. Successivamente, questo ex vivo metodo può essere combinato con ex vivo l'esposizione a farmaci per testare le risposte myogenic risultante (vasocostrizione o dilatazione del segmento del vaso a causa di esposizione al farmaco intravascolare o extravascolare).
Altre limitazioni sono approssimativamente o con impazienza rimozione di MCA dal cervello raccolto che può provocare la prematura lacerazione dei vasi, svuotando così il loro uso. Inoltre, lasciando più di un paio di minuti consentiti tra eutanasia dell'animale, raccolta dei vasi e la loro collocazione nella soluzione preparata PSS può anche negare loro vitalità. Quando correttamente eseguito e seguito, i metodi descritti nel presente protocollo per testare le risposte myogenic di MCA dopo bTBI richiede diverse ore dall'inizio alla fine e tentativi di limitare la lunghezza del tempo necessario per il successo possono provocare sperimentale fallimento. Tuttavia, questo metodo è fatto in vitro e utilizza considerevolmente più conveniente strumentazione e attrezzature rispetto a risonanza magnetica ad alta definizione in vivo (SIG)45,46 o l'ecografia convenzionale di Doppler imaging / velocimetrici tecniche47,48,49 che vengono impiegate anche per studi di nave.
Questi risultati che bTBI lieve lesione è associata con le risposte dilatorie cerebrale alterate alla ridotta pressione intravascolare potenzialmente potrebbero essere una funzione del vasospasmo6,7 e VSMC hyperconstriction50 precedentemente segnalati dopo l'esposizione di scoppio sfociare in occorrenze come ridotta perfusione cerebrale relativo. Inoltre, il danno indotto da esplosione che ostacolano le reazioni normali dilatorie del vasculature cerebrale possibilmente potrebbe promuovere ulteriori riduzioni nell'aspersione cerebrale quando combinato con ipotensione arteriosa, un frequente incidenza durante le operazioni di combattimento.
Questi risultati indicano che bTBI provoca un cambiamento per i meccanismi che agevolino il controllo vascolare arteriosa. Anche se sono stati osservati compromissione vascolare cerebrale acuto-fase di risposta miogenica arteriosa per riduzione di pressione intravascolare di alberino-ferita almeno un'ora, ci restano lacune nelle informazioni che circondano la fase acuta dopo bTBI. L'importanza di identificare quali lesioni fisiche e biochimiche carenze al sistema vascolare cerebrale e l'esposizione del cervello a bTBI cause potrebbero aiutare a determinare il livello di successo terapeutico e/o riabilitativo abbastanza immediatamente dopo la lesione.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli studi sono stati completati come parte di un team supportato da The Moody Project per la ricerca di ferita di cervello traumatica traslazionale e premio W81XWH-08-2-0132 dalla US Army Medical Research e dal comando materiale - dipartimento della difesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
| Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
| Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
| Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
| Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
| CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
| Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
| KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
| Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
| NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
| Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
| Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
| Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
| Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
| Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |
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