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Neuroscience

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/58792
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch, 2The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research, University of Texas Medical Branch

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever métodos para ex vivo determinação de reatividade vascular após uma lesão cerebral traumática de explosão primária (bTBI) usando segmentos arterial cerebral meio isolado, pressurizado, roedores (MCA). bTBI indução é realizada usando um tubo de choque, também conhecido como um dispositivo avançado explosão Simulator (ABS).

Abstract

Embora tenha havido estudos sobre os efeitos comportamentais e histopatológicos da exposição de explosão, menos tem sido dedicados a efeitos de vascular cerebral da explosão. Impacto (ou seja,, não-explosão) traumatismo cranioencefálico (TCE) é conhecido por diminuir a pressão de autoregulação na vasculatura cerebral em seres humanos e animais experimentais. A hipótese que induzida por explosão traumatismo crânio-encefálico (bTBI), como impacto TBI, resulta na reatividade vascular cerebral prejudicada foi testada pela medição miogênico respostas dilatórios a pressão intravascular reduzida em arterial cerebral médio roedor (MCA) segmentos de ratos submetidos a suave bTBI usando um tubo de choque simulador avançado de explosão (ABS). Adultos, masculinos ratos Sprague-Dawley foram anestesiados, intubados, ventilados e preparados para bTBI Sham (manipulação idêntica e anestesia exceto por lesão de explosão) ou bTBI suave. Ratos foram aleatoriamente para receber bTBI Sham ou suave bTBI seguido de sacrifício 30 ou 60 min pós-lesão. Imediatamente após bTBI, braço endireitante vezes reflexos de supressão de (RR) foram avaliados, eutanásia no tempo pós-lesão pontos foi concluída, o cérebro foi colhido e os segmentos individuais de MCA foram coletados, montados e pressurizados. Como a pressão intraluminal perfundida através dos segmentos arteriais foi reduzida em 20 mmHg incrementos de 100 para 20 mmHg, MCA diâmetros foram medidos e registrados. Com a diminuição de pressão intraluminal, MCA diâmetros aumentados significativamente acima da linha de base nos grupos Sham bTBI enquanto respostas de dilatador MCA reduziram-se significativamente (p < 0,05) em ambos os grupos bTBI como evidenciado pelos visuais, menor Diâmetros MCA gravado para os grupos de bTBI. Além disso, a supressão de RR nos grupos bTBI foi significativamente (p < 0,05) superior nos grupos Sham bTBI. MCA é coletado de bTBI o Sham grupos exibidas Propriedades Vasodilatadoras típicas para diminuições na pressão intraluminal MCA recolhidos na sequência bTBI exibida significativamente prejudicada miogênico respostas vasodilatadoras para redução de pressão que persistiu pelo menos 60 min após bTBI.

Introduction

Semelhante às decorrentes do impacto (ou seja,, não-explosão) TBI, induzida pela explosão traumatismo crânio-encefálico (bTBI) tem sido associado com a lesão vascular cerebral1 e deficientes auditivos cerebrais vasculares respostas compensatórias para ocorrências como alterações na pressão parcial de dióxido de carbono (PaCO2)2,3,4 e oxigênio (PaO2)5. Além disso, a exposição de explosão causou vasoespasmo arterial cerebral em animais6 e bTBI pacientes7,8. Enquanto clínicos TBI9 e prejuízo líquido-percussão (FPI)10,11,12 estão associados a respostas de vasculares cerebrais prejudicadas a alterações na pressão arterial (ou seja,, pressão de autoregulação)11,de10,9,12, incertezas permanecem no que diz respeito os efeitos de bTBI na capacidade de autoregulação da pressão vascular cerebral.

A circulação cerebral reage às variações na pressão arterial sistêmica, com a intenção de manter um contínuo oxigênio e nutriente abastecimento entregado ao cérebro metabolicamente ativas13,14,15, 16. Um tipo único de homeostase, autoregulação17,18,19 ocorre quando "um órgão mantém um fluxo de sangue constante apesar das mudanças na pressão arterial (perfusão) ou outros estímulos fisiológicos ou patológicos" 20. artérias cerebrais se contraem ou dilatam em resposta a variações de pressão arterial, óxido nítrico (NO), viscosidade do sangue, PaCO2 e PaO2, etc.4,11,16, 21. resposta miogênico arterial refere-se a tais contracções ou dilatações. A resposta vascular miogênico, primeiramente descrita por Bayliss22 e um mecanismo importante, contribuindo para autoregulação da CBF, caracteriza-se por vasoconstrição se aumenta a pressão de perfusão e vasodilatação se diminui a pressão de perfusão 14 , 17. esta resposta vascular é a capacidade inerente dos tecidos contráteis (tais como o músculo liso vascular células, 2R) para responder a esticar e/ou mudanças no lúmen e/ou parede tensão23,24, 25,26,,27,28,29. Quando as artérias são esticadas (por exemplo,, durante a pressão intravascular aumenta), 2R se contraem24,25,26,28.

Estudos que examinam os vasos de resistência ex vivo têm comumente empregado um dos dois métodos para testar as propriedades farmacológicas e fisiológicas dos vasos de resistência isolada: o método do anel montado e o canulado, pressurizado método. O método de preparação de navio anel montado envolve dois fios passados intraluminally através do segmento de navio, que mantêm o segmento no seu lugar. Medindo a quantidade de força aplicada nos fios sustentados isometricamente calibres a estimulação da 2R. No entanto, esta técnica acarreta certas reservas, mais notavelmente, o inevitável danos sofridos pela camada endotelial do lúmen, como os fios são passados através dele30 e o graus variados de alongamento sustentado pelo segmento isolado que por sua vez leva à distensão de parede vaso, em última análise, afetar a sensibilidade do navio a agentes farmacológicos31. A metodologia de preparação do navio canulado, pressurizado utiliza um arteriograph composto por duas câmaras separadas que cada casa a colocação de uma média arterial cerebral (MCA) colhida a partir de um único animal. Uma micropipeta é inserida em cada extremidade do segmento, a extremidade proximal do segmento é fixada a micropipeta com suturas e o lúmen é perfundido suavemente com uma solução salina fisiológica (PSS) para eliminar o sangue e outras substâncias. A extremidade distal é então fixada com suturas. Transmural ou pressão luminal é definido, elevando os dois reservatórios anexados a cada pipeta para uma altura acima de cada segmento, mas em alturas diferentes em relação a outros32,33,34,35 ,36. Transdutores de pressão posicionados ao longo de reservatórios e micropipetas fornecem medições de pressão perfusão enquanto os navios são ampliados usando um microscópio invertido equipado com um monitor, câmera de vídeo e scaler permitindo a medição de externo Diâmetros MCA. Embora ambos os métodos são valiosos, a metodologia de preparação do navio canulado, pressurizado imita melhor e licenças as navios investigaram para estar mais perto na vivo condições32,37.

Os efeitos de diferentes tipos de impacto (ou seja,, não-explosão) TBI nas respostas vasculares cerebrais anteriormente têm sido estudadas em segmentos arteriais cerebrais21,35,36,38. Usando um similar ex vivo protocolo MCA para a coleção de vasos, montagem e perfusão conforme descrito no estudo atual, uns estudos mais adiantados obteve sucesso com suas respectivas investigações sobre os mecanismos associados de disfunção da vasculatura cerebral seguir TBI. Golding et al.34 examinados dilatações endotelial mediada em adulto, do sexo masculino Long-Evans rato MCA após TCE grave devido a lesão de impacto cortical controlado (CCI). Em um segundo estudo, Golding et al36 investigado reatividade cerebrovascular a hipotensão ou CO2 depois da colheita do MCA de ratos que sustentavam uma CCI suave. Yu et al.38 analisados se respostas dilatória melhorada de peroxinitrito catadores para reduziram pressão intravascular em adultos, machos Sprague-Dawley rato MCA segmentos sujeitado a FPI enquanto Mathew et al.21 estudaram miogênico respostas para hipotensão em MCA é colhida após moderada, FPI central.

Para melhor investigar a hipótese de que bTBI, como não-explosão TBI, resultados na reatividade vascular cerebral prejudicada, testamos um mecanismo contribuindo para autoregulação comprometida pela medição miogênico respostas dilatórios a pressão intravascular reduzida ex vivo em isolado, pressurizados roedores MCA segmentos (Figura 1) coletados de ratos submetidos a suave bTBI usando um modelo de tubo de choque simulador avançado de explosão (ABS) (Figura 2 e Figura 3) (ver Rodriguez et al.39 A tabela 1) que usa ar comprimido entregado diretamente a uma câmara de motorista para gerar Freidlander, como40 sobre e sob pressão de ondas (ver Rodriguez et al.39Figura 1A).

Figure 1
Figura 1 : Localização da artéria cerebral média (MCA). Vista ventral do cérebro de ratos, destacando a localização do MCA em relação a artéria cerebral posterior (PCA), as artérias carótidas internas (ICA), artérias carótidas externas (ECA), artéria basilar (BA) e artérias carótidas comuns (CCA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Avançado dispositivo de tubo de choque explosão Simulator (ABS). O ABS usado para produzir danos de impacto em todos os animais do estudo. 1 = câmara de motorista; 2 = Câmara de expansão;  3 = câmara de amostra; 4 = supressor de onda refletida; estrela amarela = bandeja de amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da University of Texas Medical Branch, uma associação para avaliação e acreditação dos cuidados com animais de laboratório (AAALAC) credenciado facilidade.

1. animal preparação para lesão Blast ABS

  1. Ligue o ventilador mecânico volume roedores e definir a taxa de respiração entre 40-45 respirações por minuto.
  2. Interruptor por termóstato controlado aquecimento cobertor ON e gravar uma almofada azul por cima.
  3. Encaixar a mangueira de ventilação ao ventilador.
  4. Reúna o trenó de intubação endotraqueal, laringoscópio, pinça longa retirada, estilete, o tubo endotraqueal, e um cotonete de algodão embebido com 0,05 mL de 1% de lidocaína HCl. organizar na almofada azul.
  5. Confirme que roedores anestésica "bolha" câmara, ventilador, câmara de ar e isoflurano câmara mangueiras estão firmemente conectadas e ligadas à sua respectiva ficha ou soquete. O grampo de câmara de bolha anestésica deve ser aberto; a braçadeira do ventilador deve ser fechada.
  6. Na câmara de ar, ajuste o botão para o ar do quarto de 2 L/min e o botão para o oxigênio de 1 L/min.
  7. Ligue o isoflurano e coloque o selector de 4% de mistura de volume.
  8. Iniciar um timer e colocar um jovem adulto (≈3 meses de idade), sexo masculino rato Sprague-Dawley (350-400 g) na câmara de bolha de anestésico para 4-6 min.
  9. Pese o rato na marca de 2 min.
  10. Confirme o rato é totalmente anestesiado beliscando suavemente os dedos da pata traseira. Não se for observada nenhuma retirada de pata, reduzir o ar e coloque o selector de 1 L/min, oxigênio a 0,4 L/min e isoflurano a 2% de mistura de volume.
  11. Ligue o monitor de temperatura de um teletermómetro retal.
  12. Abra o grampo ao ventilador e fechar a pinça para a câmara de bolha anestésica.
  13. Remova o rato de câmara de bolha anestésica e posição no trenó de intubação endotraqueal.
  14. Entube o rato. Coloque o laringoscópio na boca do animal, use pinças tempo captador para posicionar a língua fora do caminho, cotonete ponta de cotonete de algodão embebido de lidocaína ao longo dentro da garganta e Introduza cuidadosamente o estilete que contém o tubo endotraqueal na traqueia do rato.
  15. Uma vez intubado, insira a extremidade da mangueira do ventilador para a extremidade externa do tubo endotraqueal e observar e confirmar que o rato está respirando constantemente e sem dificuldade.
  16. Prenda o tubo endotraqueal no lugar, cuidando que a língua é livre do nó.
  17. Aplicar vaselina branca a sonda um teletermómetro retal e inserir diretamente abaixo da cauda.
  18. Remova a bandeja de amostra do ABS da câmara de amostra e coloque sob a lâmpada de calor para aquecimento antes da colocação do rato na bandeja.
  19. Raspar a parte superior do couro cabeludo o rato está começando acima dos olhos e para baixo entre as orelhas.
  20. Corte um plugue de orelha de espuma tamanho padrão em metades idênticas com uma tesoura. Comece no centro da base do plugue e corte reto até a ponta arredondada. Introduza um pedaço metade cada ponta de orelha primeiro ao longo do canal de orelha até é feito contato com a membrana timpânica.
  21. Monitor de temperatura retal. Depois de alcançar uma temperatura de 37 ° C, o rato está pronto para ser carregado na bandeja de amostra do ABS.
  22. Segura o rato sobre a bandeja de amostra ABS. Retirar a mangueira de ventilação do tubo endotraqueal e rapidamente mas suavemente deslize o rato para a extremidade superior da bandeja, suavemente, guiando a cabeça através do suporte de cabeça de abertura e colar de borracha. Reinsira o tubo ventilador de volta para o tubo endotraqueal, verifique o anel de borracha para certificar-se de que está firmemente mas não firmemente em torno do pescoço e verificar que o rato está deitada em posição lateral (Figura 3).
  23. Desligue o isoflurano e retire a mangueira de ventilação do tubo endotraqueal.
  24. Bloquear e fixe a bandeja de amostra ABS contendo os ratos anestesiados para a câmara de amostra ABS.
  25. Delicadamente pitada hind pata dedos usando uma pinça longa cada 3 s, até que uma resposta de reflexo de retirada é eliciada.

2. preparação do dispositivo de explosão ABS e indução de explosão-TBI

Nota: Etapas de protocolo 2.1 – 2.10 normalmente são concluídas ao mesmo tempo como etapas 1.1 – 1,22 para que o ABS está pronto para direito de administração de lesão de explosão, depois que o rato é carregado e garantiu para a câmara de amostra.

  1. Solte o botão de bomba (Figura 4A) de hidráulica manual para permitir qualquer ar residual para escapar da câmara de condutor (Figura 4B) e solte a câmara de seu selo.
  2. Afrouxe as porcas da tampa (Figura 4C) das hastes de todos os segmentos (Figura 4D) em torno da câmara de motorista e deslize a câmara para a esquerda e longe da câmara de expansão (Figura 4E).
  3. Remova completamente as duas hastes de todos os segmentos e seus correspondentes porcas de tampão localizadas na parte superior da câmara de motorista para permitir a colocação das folhas de mylar, entre o condutor e câmara de expansão.
  4. Pilha e fita junto ao longo da borda superior quatro pré-cortado e pré-medidos (30 cm de comprimento, 20 cm de largura, 0,004 polegadas de espessura) folhas de mylar (formando uma mylar ' membrana') usando um pedaço de fita adesiva de 2,54 cm. Com segurança usando um segundo pedaço de fita, fita borda superior da membrana mylar para o topo da câmara de expansão e sobre o centro da abertura entre as câmaras de driver e expansão (Figura 4-F).
  5. Segura a câmara motorista contra a membrana de mylar, substituindo as duas hastes de tudo segmento na parte superior da câmara e aperto de mão, todas as porcas cegas em torno da câmara.
  6. Situa o acessório bloco aço contra mão hidráulico câmara da bomba bloco e motorista até encaixar firmemente.
  7. Aperte o botão da bomba hidráulica manual e confirmar que a câmara motorista permanece pressurizada com sem vazamentos, observando um limite de pressão constante no indicador da hidráulico.
  8. Abra o arquivo de aquisição de gatilho que registra traços de pressão de dispositivo de explosão ABS no computador de dispositivo de explosão de ABS.
  9. Desaperte (Figura 4G) principal botão do reservatório ar comprimido suficiente para abrir um pouco as vias aéreas.
  10. Opere a bomba hidráulica manual até que o manômetro indicador atinja a seta vermelha indicando um nível de pressão de câmara desejada de ≈5, 000 libras por polegada quadrada.
  11. Fixar e posicionar o animal anestesiado para a bandeja de amostra ABS (Figura 4H) em posição lateral (Figura 3) e fechar a bandeja de amostra na câmara de amostra de ABS (Figura 4eu).
  12. Pata de uma cerva delicadamente pitada usando uma pinça longa cada 3 s, até que uma resposta de reflexo de retirada é eliciada.
  13. Clique em Iniciar na página de aquisição aberto no computador de dispositivo de explosão de ABS.
  14. Uma vez que a janela de 'Acquisitioning' aparece na tela, pressione e mantenha pressionado o gatilho de dispositivo de explosão ABS até a explosão dispara, rompendo a membrana de mylar e administrando o prejuízo de explosão ABS (20,9 psi ±1.14, 138 ±7.9 kPa) para o rato. Logo após a explosão explode, começa um segundo temporizador para controlar quanto tempo (em min e s) decorrido pós-lesão.
  15. Remover o rato da bandeja de amostra do ABS e retornar para a almofada azul e manta de aquecimento, colocando-o totalmente de costas para a avaliação da supressão do reflexo de endireitamento.
  16. Registrar o tempo de retorno do braço endireitante reflexo. Observando o segundo temporizador, documento em min e s o comprimento de tempo pós-lesão leva o rato a rolar de costas sobre seu estômago três sucessiva vezes. Retorne o rato para a câmara de bolha anestésica.
  17. Solte o botão da bomba hidráulica manual para permitir driver câmara afrouxando e movimento.
  18. Aperte o botão principal do tanque de ar comprimido para fechar as vias respiratórias.

Figure 3
Figura 3 : Colocação de rato na bandeja de amostra ABS e dentro ABS Direção e orientação do estudo animal dentro do ABS. Quando colocado no ABS, o animal é transversal prostrada com a superfície dorsal da cabeça perpendicular à direção da onda de choque (setas vermelhas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Dispositivo de tubo choque simulador avançado de explosão (ABS) esquemático. Principais componentes do ABS. A = bomba hidráulica manual; B = câmara de motorista; C = porcas cegas; D = tudo segmento hastes;  E = câmara de expansão; F = local de colocação da membrana de mylar; G = cilindros de ar comprimido; H = bandeja de amostra; Eu = câmara de amostra.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

3. preparação da solução de roedores MCA PSS

Nota: Etapas de protocolo 3.1 – 3.3 normalmente são concluídas ao mesmo tempo como etapas 1.1 – 1,22 para ter a solução PSS está pronto para uso.

  1. Preparar e misturar uma solução fisiológica salina 1.000 mL (PSS) das seguintes concentrações e composição: 130 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO4∙7H2O; glicose de 5 mM; 1,5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3.
  2. Equilibrar o PSS com uma mistura de gás de 21% O2 e 5% de CO2 em um equilíbrio de N2. A solução está pronta quando o pH 7,4 de lê.
    Nota: Todos os gases são obtidos de cilindros de gás comprimido nas concentrações acima mencionadas.
  3. Encha os tubos com solução preparada de PSS e garrafas de reservatório e frio o restante da solução.

4. extração de segmentos de roedores MCA

  1. Depois de documentar o comprimento do braço endireitante reflexo tempo, retorne o rato para a câmara de bolha anestésica. Feche a pinça para o ventilador e abrir a pinça para a câmara. Vire o isoflurano para 4% de mistura de volume e mantenha o rato na câmara por 2 – 3 min até profundamente anestesiada.
  2. Uma vez que o rato é anestesiado, abra o grampo ao ventilador e fechar a pinça para a câmara de bolha anestésica. Reduzir o isoflurano a 2% de mistura de volume e removê-lo da câmara de bolha. Coloque-o de bruços sobre a manta de aquecimento e re-Insira a extremidade da mangueira do ventilador para a extremidade externa do tubo endotraqueal.
  3. Manter a ventilação mecânica, a uma taxa de respiração entre 40-45 respirações por minuto e anestesia em 2% de mistura de volume para 30 ou 60 min imediatamente post-bTBI lesão.
  4. Após conclusão de ambos os 30 ou 60 min tempo de sobrevida, aumentar o isoflurano a 4% de mistura de volume e profundamente anestesiar para 5-6 min. imediatamente eutanásia por decapitação usando uma guilhotina específicos de roedores.
    Nota: Nesses experimentos, mantivemos os animais anestesiados e mecanicamente ventilados após o retorno de endireitamento reflexo até decapitação.  Se o estudo requer momentos de sobrevivência mais longos, analgésicos devem ser administrados ao animal antes do surgimento da anestesia.
  5. Delicadamente, retire o cérebro o crânio. Use uma lâmina de bisturi #10 para fazer uma incisão central, do vertical e osso de profundidade 1,5 polegadas da parte superior do couro cabeludo raspado até o côndilo occipital.
  6. Use o pequeno osso ruginas para abrir e separar a pele do couro cabeludo o osso do crânio.
  7. Use ruginas grande osso para recortar e extrair o occipital, interparietal e metade inferior dos ossos frontal encerra o cérebro.
  8. Use uma espátula cirúrgica para escavar cuidadosamente o cérebro do crânio, uma vez que o cérebro está livre do osso ao seu redor.
    Nota: Tome muito cuidado quando separa o cérebro o crânio assim como rebocador desnecessariamente, para não bater ou puxar o delicado MCA segmentos da parede craniana.
  9. Deposite o cérebro colhido para a solução PSS refrigerada contida em um copo pequeno de Petri que diretamente está descansando em cima de um bloco de gelo sólido.
  10. Remova cuidadosamente a ambos a esquerda e direita MCA a partir do círculo de Willis. Continue removendo o segmento lateralmente e dorsalmente para aproximadamente 4 a 5 mm.
  11. Limpe suavemente os segmentos MCA coletados de aproximadamente 4 a 5 mm de comprimento de qualquer tecido conjuntivo usando um microfórceps.
  12. Monte o MCA sobre o arteriograph. Canule a extremidade proximal de cada segmento com a primeira micropipeta de vidro (diâmetro ≈70 µm) e prenda com uma sutura de nylon 10-0.
  13. Suavemente, perfundir o lumina com PSS para remover qualquer sangue residual e outros conteúdos do lúmen.
  14. Canule a extremidade distal de cada segmento com a micropipeta segundo sem esticar o segmento MCA e prenda com uma sutura de nylon 10-0.
  15. Após a bem sucedida montagem do segmento MCA, coloque a câmara em cima do palco de um microscópio invertido para ampliação dos vasos. O microscópio é equipado com uma câmera de vídeo, monitor e um vídeo scaler calibrado com um micrômetro óptico para medições de diâmetro arterial.
  16. Encha cada segmento e o circundante arteriograph banho com PSS continuamente circuladas aquecido da temperatura a 37º C e incubado com a mistura de gás de 21% O2 e 5% de CO2 em um equilíbrio de N2.
  17. Equilibrar os segmentos MCA a uma pressão de 50 mmHg para 60 min, elevando as garrafas de reservatório ligadas às micropipetas para uma altura adequada acima dos segmentos. Transdutores de pressão, localizados entre as micropipetas e as garrafas de reservatório irão avaliar a pressão transmural no segmento de MCA indicando quando atingir a 50 mmHg pressão desejada é atingida.
  18. Após a conclusão do período de equilibração, aumente a pressão intravascular a 100 mmHg, definindo as garrafas de reservatório em alturas diferentes.
  19. Entregar 30 mM K+ (para confirmação da contração do vaso) através o perfusato luminal e diâmetros arterial medida. Cerca de 10 min mais tarde entregar 10-5 M Ach (para a dilatação do recipiente) e medir o diâmetro arterial.
  20. Analisar respostas dilatória de navio. Baixe as garrafas de reservatório para reduzir a pressão intravascular de 100 mmHg para 80 mmHg. Permitir que os segmentos MCA equilibrar por 10 min. diâmetro arterial de medida.
  21. Reduza a pressão intravascular de 80 mmHg para 60 mmHg. Permitir que os segmentos MCA equilibrar por 10 min. diâmetro arterial de medida.
  22. Reduza a pressão intravascular de 60 mmHg a 40 mmHg. Permitir que os segmentos MCA equilibrar por 10 min. diâmetro arterial de medida.
  23. Reduza a pressão intravascular de 40 mmHg a 20 mmHg. Permitir que os segmentos MCA equilibrar por 10 min. diâmetro arterial de medida.

Representative Results

Sobrepressão de bTBI média para todos os animais do estudo foi ±1.14 20,9 libras por polegada quadrada (138 kPa ±7.9). A duração média do endireitamento supressão do reflexo (RR) de ratos submetidos à exposição de shockwave bTBI ABS (5,37 min ±2.1) não foi significativamente maior (p = 0,36, bTBI vs Souza) do que no grupo sham (±1.6 min 5,10).

Em ambos os 30 e 60 min Souza grupos, diâmetros MCA aumentaram acima da linha de base como pressão intraluminal foi reduzido de 100 para 20 mmHg. Em comparação com seus grupos de Souza correspondente, as respostas dilatórios MCA para a contínua imposta redução na pressão intravascular nos observado 30 min (p = 0,01, bTBI vs Souza) e 60 min (p = 0,02, bTBI vs Souza) ABS bTBI grupos foram significativamente reduzido, após exposição de explosão (Figura 5). Para uma discussão mais detalhada sobre estes resultados, consulte Rodriguez et al.39.

Estes estudos revelaram que leve bTBI significativamente prejudicada respostas cerebrais compensatórios dilatador para pressão intravascular reduzida em segmentos MCA, 30 e 60 min após bTBI suave, enquanto os níveis de ondas de choque suave usado nestes estudos resultou em durações de supressão de RR (< 30 s) semelhantes dos ratos Souza-ferido.

Análises estatísticas foram realizadas com o software. A miogênico resposta a mudanças na pressão intravascular foi avaliada calculando a porcentagem de alteração da linha de base (100 mmHg) para cada nível de pressão intraluminal (80, 60, 40 e 20 mmHg). Testes t de Student não pareado foram usados para avaliar as diferenças entre as linhas de base grupo bTBI e sham. As diferenças nas respostas de dilatador MCA entre grupos bTBI e sham foram avaliadas usando o teste de comparações múltiplas um Dunnett repetidas unidirecional de análise de variância (ANOVA) e teste de Bartlett, uma variação igual.

Devido à redução na potência estatística que os resultados dos testes repetidos, comparações em cada ponto de pressão específica na MCA experiências (por exemplo,, entre 80 e 100 mmHg ou entre 40 e 60 mmHg, etc) não foram realizados. Significância foi aceito para o p ≤ 0,05 nível. Todos os dados no texto, tabela referenciada e figura é expresso como significa ± erros-padrão dos meios (SEM).

Figure 5
Figura 5 : Efeitos de bTBI nas respostas de média arterial cerebral (MCA) a pressão intravascular reduzida. Respostas de dilatador de redução progressiva da pressão intravascular exibiram respostas vasodilatadoras prejudicadas e reduziram-se significativamente em 30 min (p = 0,01, bTBI vs Souza) e 60 min (p = 0,02, bTBI vs Souza) bTBI grupos (n = 6/grupo) após a exposição de explosão em comparação com os dois grupos Sham (n = 12). Em ambos os 30 e 60 min Souza grupos, diâmetros MCA aumentaram acima da linha de base como pressão intraluminal foi reduzido de 100 para 20 mmHg. Valores são plotados como significa ± SEM. *p < 0.05 vs Souza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Como com todos os protocolos e instruções, é imperativo que determinadas etapas para o protocolo neste estudo particular são seguidas com o maior rigor e tão precisamente quanto possível. Após a intubação inicial do rato é importante confirmar que está respirando constantemente e sem dificuldade. Equivocadamente, inserir o tubo endotraqueal para o esôfago, em vez de traqueia resultará em rascante, respiração difícil, sangramento e a subsequente triunfal do rato devido à deficiente entrega anestésica para os pulmões.

Quando as folhas de membrana de mylar com fita adesiva sobre o centro da abertura entre o condutor e expansão a câmara, é imperativo que os lençóis são centralizados e cobrem toda a abertura de39,41. Desalinhando os lençóis sobre a abertura irá resultar em vazamento de ar da câmara de motorista, uma queda na pressão necessária para explosão-potencial de membrana e negação da administração da lesão explosão. Situar-se adequadamente e com segurança, encaixe o acessório bloco de aço contra a bomba hidráulica manual, câmara de bloco e motorista também é essencial como é apertar o botão da bomba hidráulica manual e confirmando a câmara motorista permanece pressurizado sem vazamentos. Colocação adequada do bloco de aço permite que a câmara de motorista fechar firmemente contra a câmara de expansão, criando assim o selo obrigatório exigido pela câmara de abertura por folhas de membrana o Mylar e entre o condutor e expansão a câmara.

Durante os preparativos antes as extrações de navio MCA, gasificação do PSS com a necessária mistura de 21% O2 e 5% de CO2 em um equilíbrio de N2 se equilibra a solução e facilita o pH fisiológico neutro exigiu necessário para um trabalhando PSS solução21,33,34.

Desenroscada os segmentos a uma pressão constante para 60 min21,32,33,34 é extremamente obrigatório como esta etapa permite que os segmentos se contraiam seguinte que uma dilatação máxima exibida durante sua primeira pressurização primária. Este evento demonstra a ocorrência de Tom espontâneo, uma propriedade sugestiva de uma artéria saudável32,33,34. Embora os níveis de pressão sortidas para equilíbrio do segmento têm sido utilizados em outros estudos33,34,42, este estudo e aqueles do Mathew et al.21, Golding et al.35 e Golding et al43 equilibrado os segmentos em 50 mmHg. Enquanto desenroscada coletados segmentos em qualquer lugar entre 40 mmHg – 100 mmHg32 permite alguma flexibilidade e modificação para esse passo do protocolo, um período de equilíbrio horas dentro desses parâmetros de pressão, em última análise, confirma saudável artérias, necessárias para a continuação do experimento.

Tomar extremo cuidado ao retirar o cérebro do crânio e os segmentos MCA esquerdos e direito do círculo de Willis mantendo os navios intacto é talvez o passo mais crítico do protocolo inteiro. Perfurando o cérebro com os osso ruginas, rasgando ou grave alongamento dos segmentos durante a remoção ou acidentalmente, puxando os vasos com a espátula cirúrgica, quando o cérebro do crânio de escavação, finalmente, resultará na destruição da colheita MCA, causando segmentos inservíveis e descontinuado o uso desse conjunto de artérias, em última análise, anulando todo o experimento por aquele animal.

Embora respostas vasculares cerebrais a estímulos dilatórios ou constrictory em MCA segmentos ex vivo de medição recolhidos após o impacto ou explosão TBI em vivo rendeu sucesso, a metodologia não é sem suas dificuldades e/ou limitações. Talvez uma das mais perceptíveis complexidades associadas ao examinar as consequências da TBI na circulação da vasculatura cerebral é desanexando os efeitos explícitos de TCE nos navios dos efeitos implícitos decorrentes dos vários materiais e elementos gerados pelo cérebro lesionado44. Esta perplexidade concebível potencialmente pode ser evitada através da análise de ex vivo as reações vasoconstrictory e vasodilatadoras de colhidas, perfundidos e/ou pressurizado do MCA. Em um esforço para reduzir a duração do tempo que artérias cerebrais in vivo são expostas localmente apurado parenquimatosa vasoativas material antes da morte, a coleção das artérias cerebrais diretamente após TBI pode diminuir o grau de tal exposição prolongada efeitos. Ex vivo estudos sobre do MCA isolado adicionalmente apresentar a perspectiva de analisar os mecanismos de lesão vascular com o uso de particular receptores agonistas e antagonistas ou veículos reputados de lesão vascular que não iria pagar o escrutínio como eficientemente, ou como discriminatórias na vivo. Posteriormente, este ex vivo método pode ser combinado com ex vivo exposição às drogas para testar respostas miogênico resultantes (vasoconstrição ou dilatação do segmento de vaso devido à exposição de drogas intravascular ou extravascular).

Outras limitações incluem aproximadamente ou impacientemente retirar a MCA cérebro colhido o que pode resultar em rasgar prematura dos vasos, anulando assim a sua utilização. Além disso, deixar mais alguns minutos decorridos entre a eutanásia do animal, coleção dos navios e seu posicionamento na solução preparada PSS pode anular sua viabilidade. Quando adequadamente realizado e a seguiu, os métodos descritos neste protocolo para testar respostas miogênico do MCA, depois bTBI leva várias horas do início ao fim e tentativas de reduzir o período de tempo necessário para o sucesso podem resultar em experimental falha. No entanto, este método é feito in vitro e utiliza consideravelmente mais cost-effective instrumentação e equipamento do que in vivo de ressonância magnética de alta resolução (MR) de imagem45,46 ou ecografia Doppler convencional / técnicas velocimetric47,,48,49 que também são empregadas para estudos de navio.

Esses achados que bTBI leve lesão está associado com respostas de dilatórios cerebrais prejudicadas a pressão intravascular reduzida potencialmente podem ser uma função do vasoespasmo6,7 e 2R hyperconstriction50 anteriormente relatados após exposição de explosão, finalmente levando à ocorrências tais como redução relativa da perfusão cerebral. Além disso, induzida pela explosão danos dificultando reações normais de dilatórios da vasculatura cerebral poderiam possivelmente promover reduções na perfusão cerebral quando combinado com hipotensão arterial, uma incidência frequente durante as operações de combate.

Estes resultados indicam que bTBI resulta em uma mudança para os mecanismos que facilitem o controle vascular arterial. Apesar de fase aguda imparidade vascular cerebral de resposta miogênico arterial a reduções na pressão intravascular pelo menos uma pós-lesão hora foram observadas, continua a haver lacunas nas informações que cercam a fase aguda após bTBI. A importância de identificar que lesões de deficiências físicas e bioquímicas para a vasculatura cerebral e a exposição do cérebro a bTBI causas podem auxiliar na determinação do nível de sucesso terapêutico e/ou reabilitação razoavelmente imediatamente após a lesão.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Estudos foram concluídos como parte de uma equipa apoiada pelo The Moody Project para investigação de lesão cerebral traumática translação e prêmio W81XWH-08-2-0132 da pesquisa médica do exército dos Estados Unidos e comando de Material - departamento de defesa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Blast Simulator (ABS) Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. N/A Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries 
Adult, male, Sprague-Dawley rats  Charles River Laboratories N/A Experimental animals
Arteriograph Living Systems Instrumentation, Inc. Arteriograph Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter 
Bone rongeurs, large FST Fine Science Tools Friedman Rongeur Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small FST Fine Science Tools Boynton Rongeur Brain extraction from skull
CaCl2  Sigma Calcium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs 3M Foam Ear Plugs 1100 Class AL  Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine 
Glucose Sigma D-[+]-Glucose Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane  Piramal Enterprises Limited  Isoflurane, USP Anesthetic
KCl Sigma Potassium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO4•7H2O  Sigma Magnesium sulfate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps Buxton Biomedical Inc. Micro Tying Fcps, 180mm Brain extraction from skull
Mylar sheets Texas Art Supply Mylar Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl Sigma Sodium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO3 Sigma Sodium bicarbonate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture Ethicon 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter      
Scalpel blade #10 Bard-Parker 10 Stainless Steel Surgical Blade Brain extraction from skull
Surgical spatula Delmaks Surgico Cement Spatula  Brain extraction from skull
Thermometer  Physitemp Instruments, Inc.,  Thermalert Monitoring Thermometer Monitoring of experimental animal's core body temperature 
Volume ventilator  Harvard Apparatus, Inc. Small Animal Ventilator Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket Gaymar Industries, Inc.  Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad Maintenance of experimental animal's body temperature 

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Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio
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Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, … More

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).

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