Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière
Summary
We presenteren een fluorescentie test om aan te tonen dat Lucifer Yellow (LY) een robuuste marker is om de schijnbare paracellulaire permeabiliteit van hCMEC/D3 celmonolagen te bepalen, een in vitro model van de menselijke bloed-hersen barrière. We gebruikten deze assay om de kinetiek van een confluente monolaag-formatie in gekweekte hcmec/D3-cellen te bepalen.
Abstract
De bloed-hersen barrière BBB bestaat uit endotheliale cellen die een barrière vormen tussen de systemische circulatie en de hersenen om de uitwisseling van niet-essentiële ionen en giftige stoffen te voorkomen. Nauwe kruisingen (TJ) dichten de paracellulaire ruimte in de monolagen effectief, wat resulteert in een intacte barrière. Deze studie beschrijft een LY-gebaseerde fluorescentie test die kan worden gebruikt om de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (P-app) te bepalen en kan op zijn beurt worden gebruikt om de kinetiek van de vorming van confluente monolagen te bepalen en de resulterende nauwe junctie barrière-integriteit in monolayers van hCMEC/D3. Verder demonstreren we een aanvullend nut van deze assay om de functionele integriteit van TJ in getranssinfecteerde cellen te bepalen. Onze gegevens uit de LY Papp assay toont aan dat de hCMEC/D3-cellen die in een trans well-opstelling zijn gesekt, effectief de grens van de paracellulaire transport 7 dagen-post cultuur beperken. Als aanvullend nut van de gepresenteerde testtonen we ook aan dat de transfectie van de DNA-nanodeeltjes het paracellulaire transport in monolayers van hCMEC/D3 niet verandert.
Introduction
Bloed-hersen barrière (BBB) is de beschermende barrière de instroom van plasma componenten in het hersenweefsel te beperken en bestaat uit hersen endotheliale cellen samen met ondersteunende cellen zoals pericytes. De belangrijkste rol van BBB is om te dienen als een barrière die de ruimte tussen perifeer bloed en het centrale zenuwstelsel (CNS) verzegelt om hemostase van de neurale micro omgeving1,2te handhaven. De hersen capillaire endotheel cellen verzegelen effectief de paracellulaire route via de vorming van intercellulaire strakke knooppunten (TJs)1. Deze beschermende barrière maakt het mogelijk glucose en geselecteerde voedingsstoffen in de hersenen, terwijl het voorkomt dat de meerderheid van de ionen, giftige stoffen en drugs van het passeren van deze strakke barrière. Afgezien van zijn beschermende rol, vormt de natuurlijke barrièrefunctie van de BBB een ernstige uitdaging in de ontwikkeling van systemen voor het leveren van geneesmiddelen gericht op het CZS.
In vitro celkweek modellen van de BBB zijn handige hulpmiddelen om de biologie te bestuderen en om de effecten van medicamenteuze behandeling op de integriteit van TJ Barrier te begrijpen. We gebruikten de humane cerebrale microvasculaire endotheliale cellijn (hcmec/D3) als een in vitro model, omdat het een geaccepteerd model is van Human Brain endotheel3 en vele functies van de menselijke BBB herformuleert. hcmec/D3is een van de meest gebruikte cellijnen voor het modelleren van de BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Ondanks de relatief lage waarden van transendotheliale elektrische weerstand (TEER), een maat voor barrière dichtheid, behoudt deze cellijn het grootste deel van de morfologische en functionele eigenschappen van hersen endotheliale cellen, zelfs als een monocultuur bij afwezigheid van gecocultureerde gliacellen6,7. De cellijn hcmec/D3 drukt meerdere BBB-markers uit, inclusief actieve transporters en receptoren tot ongeveer passage 35 zonder dedifferentiatie te ondergaan aan unstable fenotypes6,7,9 ,10,11. Het meest opvallende kenmerk van de hcmec/D3-cellijn als een in vitro BBB-model is de mogelijkheid om tjs5,9,11,12te vormen. Opgemerkt moet worden dat hoewel stamcel-afgeleide BBB-modellen een hogere permeabiliteit vertoonden in veel studies in vergelijking met de cellijn van hCMEC/D3 en ze enkele BBB-markers uitdrukken, ze zijn nog niet te evolueren als de meest voorkomende BBB-cel model13. Belangrijk is dat stamcel afgeleide BBB-modellen nog steeds worden gekarakteriseerd met betrekking tot maximale passage nummers die de cellen in staat stellen stabiele BBB-fenotypes14te handhaven.
Drie primaire methoden worden vaak gebruikt om de integriteit van de TJ-barrière te bepalen, waaronder de meting van de TEER, de meting van de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (P-app) van kleine hydrofiele Tracer moleculen zoals sucrose, inuline, Lucifer geel, etc. en immunokleuring van bekende moleculaire markers van TJs zoals Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER is een relatief eenvoudige en kwantitatieve methode die de elektrische weerstand meet over de celmonolagen gekweekt op een poreus membraan substraat5. De TEER waarden kunnen echter worden beïnvloed door experimentele variabelen zoals de samenstelling van het kweekmedium en het type meetinstrument. Een waarschijnlijke combinatie van deze factoren leidt tot een brede verdeling van de TEER waarden variërend van 2 tot 1150 Ω cm2 in de hCMEC/D3 cellijn gekweekt voor 2-21 dagen13. Immunokleuring is een visuele methode om de aanwezigheid van TJ-eiwitten te bepalen door het beoogde eiwit te labelen met antilichamen. Bij immunokleuring gaat het echter om een reeks experimentele stappen, waaronder de noodzaak om cellen op te lossen/te permeiseren die kunnen resulteren in experimentele artefacten en de fluorescerende signalen kunnen vervagen na verloop van tijd. De bovenstaande factoren kunnen leiden tot subjectieve fouten die de kwaliteit van gegevens beïnvloeden.
De primaire focus van dit werk is het presenteren van een ly-based schijnbare permeabiliteit assay bepalen de kinetiek van een confluente monolaag vorming in gekweekte hcmec/D3 cellen. Hoewel andere geavanceerde in vitro BBB-systemen, zoals co-cultuur systemen, microfluïdische systemen, fysiologisch relevantere mimieken zijn met een significant verbeterde barrièrefunctie15,16,17, de hcmec/D3 trans well Setup is een eenvoudig en betrouwbaar model om de kinetiek van TJ Formation te schatten en het effect van verschillende geneesmiddel formuleringen op de barrièrefunctie snel op te schermen. In het algemeen zijn de waarden van de P-app consistent voor verschillende hydrofiele opgeloste stoffen in monolagen van hcmec/D3. Bijvoorbeeld, de gerapporteerde Papp waarden voor verschillende laagmoleculaire massa opgeloste stoffen (zoals sucrose, mannitol, ly, etc.) in verschillende in vitro BBB modellen zijn in de orde van 10-4 cm/min5,18,19 , 20. in onze experimentele opstelling worden de hersen endotheel cellen op een microporeus membraan met collageen coating voor celbevestiging en monolaag vorming gesest om de in vivo barrière na te bootsen. De LY toegevoegd in de apicale kant wordt naar verwachting doorkruisen de intercellulaire strakke kruisingen en accumuleren in de basolaterale kant. Grotere concentraties van LY in de basolaterale kant duiden op een onrijpe, niet-volledig functionele barrière, terwijl lagere concentraties het beperkte transport weerspiegelen als gevolg van de aanwezigheid van functionele TJs resulterend in een volwassen barrière.
LY is een hydrofiele kleurstof met verschillende excitatie/emissie pieken en vermijdt de noodzaak van van Tracer moleculen zoals sucrose, mannitol of inuline. Zo kunnen de fluorescentie waarden van LY worden gebruikt om de paracellulaire permeabiliteit over de BBB-monolagen direct te berekenen. Ook, in vergelijking met veel commercieel verkrijgbare kleurstoffen die worden gebruikt in biomedische velden die lijden aan kleine Stokes verschuivingen zoals fluoresceïne21, de Stokes verschuiving van ly is ongeveer 108 nm met voldoende spectrale scheiding, waardoor ly fluorescentie gegevens als een robuuste uitlezen om de paracellulaire permeabiliteit te bepalen. We gebruikten Western blotting als een orthogonale techniek om veranderingen in de expressie van de nauwe Junction marker eiwit, ZO-1, over cultuur tijd aan te tonen. ZO-1-expressie gedetecteerd via Western blotting wordt gebruikt om de ly p-app -gegevens aan te vullen en in combinatie suggereren deze gegevens dat de waargenomen veranderingen in de ly p-app -waarden een afspiegeling zijn van de vorming van een monolaag met een geleidelijke toename van expressie van de nauwe Junction marker, ZO-1.
Zoals eerder gezegd, is de centrale focus van dit werk het aantonen van een ly assay als een eenvoudige techniek om de vorming van een confluente monolaag met functionele strakke kruisingen te monitoren. Om echter een aanvullend nut van de ontwikkelde assay aan te tonen, hebben we de LY P-app gemeten in monolayers met DNA-nanodeeltjes-Getransfunteerde hCMEC/D3. Nucleïnezuren kunnen worden gecondenseerd in poly elektrolyt nanodeeltjes met een diameter van 100-200 nm via elektrostatische interactie tussen de positief geladen groepen polymeren en de negatief geladen fosfaat groepen van nucleïnezuren22, 23. we verwijzen naar deze complexen als DNA-nanodeeltjes (DNA NPs) in ons werk. Hoewel het onze bedoeling is om cellen te transfect en het gewenste eiwit uit te drukken, moeten we ervoor zorgen dat de barrière-eigenschappen van de monolagen van hcmec/D3 niet in het gedrang komen. Onze gegevens suggereren dat een standaard 4 h plaats gentransfectie regime niet meetbaar de ly permeabiliteit van het nut van de ly Papp assay verandert om veranderingen in de integriteit van TJ Barrier te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een belangrijke rol van de BBB is om te voorkomen dat de uitwisseling van niet-essentiële ionen en giftige stoffen tussen de systemische circulatie en de hersenen om hemostase van neurale micro-omgeving te handhaven. Een van de karakteristieke kenmerken van de BBB is het vermogen van de capillaire endotheliale cellen om strakke kruispunten (TJs) te vormen die effectief de paracellulaire route van het transport verzegelen. We toonden een LY Papp assay als een kwantitatieve methode om de schijnbare kinetiek van…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de 2017 nieuwe Investigator Award van de American Association of Pharmacy, een Hunkele dreaded Disease Award van de Duquesne University en de start-up fondsen voor de school of Pharmacy voor het Manickam Laboratory. We willen graag het lek laboratorium (Duquesne University) bedanken voor Western blotting Assistance en het gebruik van hun Odyssey 16-bit Imager toestaan. We willen ook een speciale nota van waardering voor Kandarp Dave (Manickam Laboratory) voor hulp bij Western blotting opnemen.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
Riferimenti
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
- Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
- Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
- Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
- Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
- Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
- Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
- Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
- Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
- Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
- Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
- Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).
