Люцифер желтый - Надежный параклеточной проницаемости маркер а в клеточной модели человеческого кровяного мозга барьер
Summary
Мы представляем флуоресценции анализ, чтобы продемонстрировать, что Люцифер желтый (LY) является надежным маркером для определения очевидной параклеточной проницаемости hCMEC /D3 клеточных монослоев, в пробирке модель человеческого гематоэнцефалического барьера. Мы использовали этот ацензию для определения кинетики сольственного монослойного образования в культурных клетках hCMEC/D3.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер BBB состоит из эндотелиальных клеток, которые образуют барьер между системной циркуляции и мозга, чтобы предотвратить обмен несущественных ионов и токсичных веществ. Плотные соединения (TJ) эффективно уплотнять параклеточное пространство в монослойных в результате чего нетронутыми барьер. Это исследование описывает LY основе флуоресценции ассс, который может быть использован для определения его очевидного коэффициента проницаемости (Pприложение) и, в свою очередь, может быть использован для определения кинетики формирования слияния монослойных и в результате жесткой связи барьерцелостноста в монослойах hCMEC/D3. Мы также демонстрируем дополнительную полезность этого исследования для определения функциональной целостности TJ в трансинфицированных клетках. Наши данные из LY Pприложение анализа показывает, что hCMEC /D3 клетки, посеянные в трансвелл установки эффективно ограничить LY параклеточного транспорта 7 дней после культуры. В качестве дополнительной полезности представленного анализа мы также демонстрируем, что трансфекция наночастиц ДНК не изменяет пароклеточный перенос LY в монослойах hCMEC/D3.
Introduction
Барьер крови-мозг (BBB) защитный барьер ограничивая приток компонентов плазмы в ткань мозга и состоит из эндотелиальных клеток мозга наряду с поддерживающими клетками, такими как перициты. Основная роль BBB заключается в том, чтобы служить в качестве барьера, который уплотняет пространство между периферической крови и центральной нервной системы (ЦНС) для поддержания гемостаза нервной микросреды1,2. Капиллярные эндотелиальные клетки мозга эффективно уплотняют параклеточный путь через образование межклеточных узких узлов (TJs)1. Этот защитный барьер позволяет глюкозе и выбранным питательным веществам проникать в мозг, в то время как он предотвращает прохождение через этот жесткий барьер большинство ионов, токсичных веществ и лекарств. Помимо своей защитной роли, функция естественного барьера BBB представляет собой серьезную проблему в разработке систем доставки лекарств, ориентированных на ЦНС.
Модели культуры клеток In vitro BBB являются полезными инструментами для изучения его биологии и понимания влияния лечения наркотиками на целостность Барьера TJ. Мы использовали микрососудистую эндотелиальную линию мозга человека (hCMEC/D3) в качестве модели in vitro, так как она является общепринятой моделью эндотелия мозга человека3 и резюмирует многие функции человеческого BBB. hCMEC/D3is один из наиболее часто используемых клеточныхлиний для моделирования BBB in vitro 4,5,6,7,8. Несмотря на свои сравнительно низкие значения трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER), мера герметичности барьера, эта линия клетки сохраняет большую часть морфологических и функциональных свойств эндотелиальных клеток мозга, даже как монокультура при отсутствии cocultured глиальных клеток6,7. Линия клеток hCMEC/D3 выражает несколько маркеров BBB, включая активные транспортеры и рецепторы до приблизительно прохождения 35 без прохождения дедифференцирования к нестабильным фенотипам6,7,9 ,10,11. Наиболее поразительной характеристикой линии клеток hCMEC/D3 в качестве моделиin vitro BBB является ее способность формировать TJs 5,9,11,12. Следует отметить, что, хотя стволовые клетки полученных bBB модели показали более высокую проницаемость во многих исследованиях по сравнению с hCMEC / D3 клеточной линии, и они выражают некоторые маркеры BBB, они еще не развиваться как наиболее распространенные модели BBB ячейки13. Важно отметить, что стволовые клетки, полученные bBB модели по-прежнему характеризуются по отношению к максимальным числам прохода, которые позволяют клеткам поддерживать стабильные фенотипы BBB14.
Три основных метода обычно используются для определения целостности барьера TJ, включая измерение TEER, измерение коэффициента проницаемости (Papp) малых гидрофильных молекул трассировщика, таких как сахароза, инулин, Люцифер желтый, и т.д. и иммуно-пятно известных молекулярных маркеров TJs, таких как claudin-5, ЗО-1, окклудин и т.д.5. TEER является относительно простым и количественным методом, который измеряет электрическое сопротивление черезмонослои клеток, культивированные на пористых мембранных субстратах 5. Однако значения TEER могут зависеть от экспериментальных переменных, таких как состав культуры и тип измерительного прибора. Вероятное сочетание этих факторов приводит к широкому распределению значений TEER в диапазоне от 2 до 1150 см2 в линии клеток hCMEC/D3, культивируется в течение 2-21 дней13. Immunostaining является визуальным методом, чтобы определить наличие TJ белков путем маркировки целевого белка с использованием антител. Тем не менее, иммуностоирование включает в себя ряд экспериментальных шагов, в том числе необходимость исправить / пермяки клеток, которые могут привести к экспериментальным артефактов и флуоресцентные сигналы могут исчезать с течением времени. Вышеуказанные факторы могут привести к субъективным ошибкам, влияющим на качество данных.
Основное внимание в этой работе заключается в представлении LY основе очевидной проницаемости ассссопределить определить кинетику созидательного монослой образования в культивированных hCMEC / D3 клеток. Хотя другие передовые системы in vitro BBB, такие как системы совместной культуры, микрофлюидные системы, физиологически более актуальны, с значительно улучшенной барьерной функцией15,16,17, hCMEC/D3 Трансвелл установка является простой и надежной моделью для оценки кинетики формирования TJ и быстро экранировать влияние различных препаратов на барьерфункции. В целом значенияP-приложений согласуются для различных гидрофильных растворов в монослойах hCMEC/D3. Например, заявленные значенияp-приложений для различных низкомолекулярных масс solutes (таких как сахароза, маннитол, LY и т.д.) в различных моделях in vitro BBB находятся в порядке 10-4 см/мин5,18,19 , 20. В нашей экспериментальной установки, мозг эндотелиальных клеток посеяны на коллагена покрытием микропористые мембраны для клеточной привязанности и монослой образования, чтобы имитировать барьер in vivo. LY добавил в апической стороне, как ожидается, пройти межклеточные узкие соединения и накапливаются в базолатеральной стороне. Более высокие концентрации LY в базолатеральной стороне указывают на незрелый, не полностью функциональный барьер, в то время как более низкие концентрации отражают ограниченный транспорт из-за наличия функциональных TJ, что приводит к зрелому барьеру.
LY является гидрофильной краситель с различными возбуждения / выбросы пиков и позволяет избежать необходимости радиомаркировки трассировщик молекул, таких как сахароза, маннитол или инулин. Таким образом, значения флуоресценции LY могут быть использованы для непосредственного расчета его параклеточной проницаемости через монослои BBB. Кроме того, по сравнению со многими коммерчески доступные красители, используемые в биомедицинских областях, которые страдают от небольших сдвигов Стокса, таких как флуоресцеин21, Стокс сдвиг LY составляет около 108 нм с достаточным спектральным разделением, что позволяет LY флуоресценции данных, как надежный считывание для определения параклеточной проницаемости. Мы использовали западные blotting как orthogonal метод для того чтобы продемонстрировать изменения в выражении плотного протеина маркера соединения, no zo-1, над временем культуры. Выражение ЗО-1, обнаруженное с помощью западного блоттинга, используется для дополнения данныхприложения LY P и в сочетании эти данные позволяют предположить, что наблюдаемые изменения в значенияхприложения LY P отражают образование монослой с постепенным увеличением выражение плотного маркера соединения, ЗО-1.
Как указывалось ранее, в центре внимания этой работы является демонстрация LY анализ как простой метод для мониторинга формирования слияния монослой с функциональными плотными соединениями. Однако, чтобы продемонстрировать дополнительную полезность разработанного анализа, мы измерилиприложение LY P в наночастицах ДНК-трансфицированных монослойах hCMEC/D3. Нуклеиновые кислоты могут быть конденсированы в полиэлектролитные наночастицы диаметром 100-200 нм с помощью электростатического взаимодействия между положительно заряженными группами полимеров и отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот22, 23. Мы ссылаемся на эти комплексы как наночастицы ДНК (ДНК NPs) в нашей работе. Хотя наше намерение состоит в том, чтобы трансфектировать клетки и выразить желаемый белок, мы должны обеспечить, чтобы барьерные свойства монослойов hCMEC/D3 не были скомпрометированы. Наши данные свидетельствуют о том, что стандартный режим трансфекции генов 4 h luciferase не измеримо изменяет проницаемость LY, демонстрирующую полезностьанализа приложения LY P для определения изменений в целостности барьерного барьера TJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ключевая роль BBB заключается в предотвращении обмена несущественных ионов и токсичных веществ между системной циркуляции и мозга для поддержания гемостаза нейронной микросреды. Одной из характерных особенностей BBB является способность капиллярных эндотелиальных клеток образовыват?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны за финансовую поддержку от 2017 Новый следователь премии от Американской ассоциации фармации, Hunkele Dreaded Disease награду от Duquesne университета и школы фармации стартовых средств для лаборатории Manickam. Мы хотели бы поблагодарить лабораторию утечки (Duquesne University) за западную помощь blotting и разрешение на использование их Одиссея 16-битный imager. Мы также хотели бы включить специальную ноту признательность за Kandarp Dave (Manickam лаборатории) за помощь в западной blotting.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
Riferimenti
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
- Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
- Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
- Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
- Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
- Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
- Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
- Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
- Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
- Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
- Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
- Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).
