JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

Published: August 19, 2019
doi:
10.3791/58900
, , ,
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences,Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences,University of Kentucky

Summary

Biz Lucifer Sarı (LY) hCMEC / D3 hücre monolayers, insan kan-beyin bariyerinin bir in vitro modeli görünür parasellüler geçirgenlik belirlemek için sağlam bir belirteç olduğunu göstermek için bir floresan tahlili salıyoruz. Bu analizi, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde etkili bir monolayer oluşumunun kinetiklerini belirlemek için kullandık.

Abstract

Kan-beyin bariyeri BBB, gerekli olmayan iyonlar ve toksik maddelerin değişimini önlemek için sistemik dolaşım ve beyin arasında bir bariyer oluşturan endotel hücrelerinden oluşur. Sıkı kavşaklar (TJ) etkili bir bozulmamış bariyer sonuçlanan monolayers parasellüler alanı mühür. Bu çalışmada, görünür geçirgenlik katsayısını (P uygulaması) belirlemek için kullanılabilen LYtabanlı floresan titreci açıklanır ve buna karşılık konjenital monolayers oluşumunun kinetik ve ortaya çıkan sıkı kavşak hCMEC/D3 monokatmanlarında bariyer bütünlüğü. Transfected hücrelerde TJ fonksiyonel bütünlüğünü belirlemek için bu tispatın ek bir yararını da gösteriyoruz. LY Puygulama analizinden elde edilen veriler, transwell kurulumunda tohumlanan hCMEC/D3 hücrelerinin LY parasellüler taşımayı 7 gün sonra kültürünü etkili bir şekilde sınırladığını göstermektedir. Sunulan çıktının ek bir faydası olarak, DNA nanopartikül transfeksiyonunun hCMEC/D3 monokatmanlarında LY parasellüler aktarımını değiştirmediğini de gösteriyoruz.

Introduction

Kan-beyin bariyeri (BBB) beyin dokusuna plazma bileşenlerinin akını sınırlayan koruyucu bariyer ve perisitler gibi destekleyici hücreler ile birlikte beyin endotel hücrelerinden oluşur. BBB’nin ana rolü, nöral mikroçevrenin hemostazını korumak için periferik kan ve merkezi sinir sistemi (CNS) arasındaki boşluğu kapatan bir bariyer görevigörmektir. Beyin kapiller endotel hücreleri etkili hücreler arası sıkı kavşakoluşumu yoluyla parasellüler yolu mühür (TJs)1. Bu koruyucu bariyer, glikoz ve seçilmiş besinlerin beyne girmesini sağlarken, iyonların, toksik maddelerin ve ilaçların çoğunun bu sıkı bariyerden geçmesini engeller. Koruyucu rolünün yanı sıra, BBB’nin doğal bariyer işlevi CNS’yi hedef alan ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde ciddi bir sorun teşkil etmektedir.

BBB in vitro hücre kültürü modelleri biyolojisini incelemek ve ilaç tedavisinin TJ bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini anlamak için yararlı araçlardır. İnsan beyin endotel 3’ün kabul edilen bir modeli olduğu ve bbb’nin birçok fonksiyonlarını özetlediğinden, insan serebral mikrovasküler endotel hücre hattını (hCMEC/D3) in vitro model olarak kullandık. hCMEC/D3is bbb in vitro modelleme için en sık kullanılan hücre hatlarından biridir4,5,6,7,8,9. Bariyer sıkılığının bir ölçüsü olan transendotel elektrikdirencinin (TEER) nispeten düşük değerlerine rağmen, bu hücre hattı beyin endotel hücrelerinin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin çoğunu korur. cokültürd glial hücreler6,7. hCMEC/D3 hücre hattı, kararsız fenotiplere defarklılaşma geçirmeden yaklaşık 35 geçişine kadar aktif taşıyıcılar ve reseptörler de dahil olmak üzere birden fazla BBB belirteçlerini ifade eder6,7,9 ,10,11. Bir in vitro BBB modeli olarak hCMEC/D3 hücre hattının en çarpıcıözelliği TJs 5,9,11,12oluşturmak için yeteneğidir. Kök hücre kaynaklı BBB modellerinin hCMEC/D3 hücre hattı ile karşılaştırıldığında birçok çalışmada daha yüksek geçirgenlik gösterdiği ve bazı BBB belirteçlerini ifade ettikleri unutulmamalıdır, ancak en yaygın BBB hücre modeli13olarak gelişmemiştir. Daha da önemlisi, kök hücre türetilmiş BBB modelleri hücrelerin kararlı BBB fenotipleri korumakiçin izin maksimum geçiş sayıları ile ilgili olarak karakterize olmaya devam 14 .

Teer ölçümü, sakaroz, inulin, Lucifer Sarı gibi küçük hidrofilik tracermoleküllerinin görünür geçirgenlik katsayısının (P uygulaması) ölçümü de dahil olmak üzere TJ bariyer bütünlüğünü belirlemek için üç ana yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. vb. ve claudin-5, ZO-1, oklüdin, vb5gibi TJs bilinen moleküler belirteçleri immunostaining . TEER, gözenekli membran substrat5üzerinde kültürlenmiş hücre monolayers arasındaki elektrikdirencini ölçen nispeten basit ve nicel bir yöntemdir. Ancak TEER değerleri, kültür ortamının bileşimi ve ölçüm aletinin türü gibi deneysel değişkenlerden etkilenebilir. Bu faktörlerin olası bir kombinasyonu, hCMEC/D3 hücre hattında 2-21 gün 13’te 2 ila 1150 Ωcm2 arasında değişen TEER değerlerinin geniş bir dağılımına yol açar. İmmünoboyama, hedeflenen proteini antikorlar kullanarak etiketleyerek TJ proteinlerinin varlığını belirlemek için kullanılan görsel bir yöntemdir. Ancak, immünboyama deneysel eserler ve floresan sinyalleri zaman içinde kaybolabilir neden olabilir hücreleri düzeltmek / permeabilize ihtiyacı da dahil olmak üzere deneysel adımlar, bir dizi içerir. Yukarıdaki etkenler veri kalitesini etkileyen öznel hatalara yol açabilir.

Bu çalışmanın temel odak noktası, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde enfluent monolayer oluşumunun kinetiklerini belirleyen LY tabanlı belirgin geçirgenlik testini sunmaktır. Co-kültür sistemleri, mikroakışkan sistemler gibi diğer gelişmiş in vitro BBB sistemleri, fizyolojik olarak daha uygun mimikler önemli ölçüde geliştirilmiş bariyer fonksiyonu15,16,17, hCMEC/D3 ile transwell kurulumu, TJ oluşumunun kinetiklerini tahmin etmek ve farklı ilaç formülasyonlarının bariyer fonksiyonu üzerindeki etkisini hızla taramak için basit ve güvenilir bir modeldir. Genel olarak, Puygulama değerleri hCMEC/D3 monokatmanlarında çeşitli hidrofilik soluteler için tutarlıdır. Örneğin, farklı in vitro BBB modellerinde çeşitli düşük moleküler kütleli soluteler (sakaroz, mannitol, LY, vb. gibi) için bildirilen Puygulama değerleri 10-4 cm/dk5,18,19 , 20– Deneysel kurulumumuzda beyin endotel hücreleri in vivo bariyerini taklit etmek için hücre eki ve monolayer oluşumu için kollajen kaplı mikrogözenekli membran üzerine seri olarak eklenir. Apikal tarafa eklenen LY’nin hücreler arası sıkı kavşaklardan geçmesi ve basolateral tarafta birikmesi beklenmektedir. Basolateral tarafta ki LY konsantrasyonlarının daha fazla olması olgunlaşmamış, tam olarak işlevsel olmayan bir bariyeri gösterirken, daha düşük konsantrasyonlar olgun bir bariyerle sonuçlanan fonksiyonel TJ’lerin varlığı nedeniyle sınırlı taşımayı yansıtır.

LY farklı uyarma / emisyon zirveleri ile bir hidrofilik boya ve sakaroz, mannitol veya inulin gibi radyolabel tracer molekülleri ihtiyacını önler. Böylece LY’nin floresan değerleri, BBB monokatmanları arasında parasellüler geçirgenliğini doğrudan hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, floresan21gibi küçük Stokes vardiya muzdarip biyomedikal alanlarda kullanılan birçok ticari boyaile karşılaştırıldığında, LY Stokes kayması yeterli spektral ayırma ile yaklaşık 108 nm, böylece LY floresan veri olarak izin parasellüler geçirgenliği belirlemek için sağlam okuma. Biz sıkı kavşak marker protein, ZO-1, kültür zaman içinde ifade değişiklikleri göstermek için bir ortogonal teknik olarak Batı lekeleme kullanılır. Batı lekeleme yoluyla saptanan ZO-1 ekspresyonu LY Puygulama verilerini tamamlamak için kullanılır ve bu veriler LY Puygulama değerlerinde gözlenen değişikliklerin kademeli olarak sıkı kavşak işareti, ZO-1 ifadesi.

Daha önce de belirtildiği gibi, bu çalışmanın odak noktası, fonksiyonel sıkı kavşaklara sahip bir tek tabakanın oluşumunu izlemek için basit bir teknik olarak LY tözünü göstermektir. Ancak, geliştirilen testin ek bir faydasını göstermek için, LY Puygulamasını DNA nanopartikül enine hCMEC/D3 monolayers cinsinden ölçtük. Nükleik asitler polimerlerin pozitif yüklü grupları ve nükleik asitlerin negatif yüklü fosfat grupları arasında elektrostatik etkileşim yoluyla 100-200 nm çapında polielektrolit nano tanecikleri içine yoğunlaşmış olabilir22, 23. Bu kompleksleri çalışmamızda DNA nano tanecikleri (DNA NPs) olarak adlandırıyoruz. Amacımız hücreleri transfect ve istenilen proteinifade etmek iken, biz hCMEC / D3 monolayers bariyer özellikleri ödün olmadığından emin olmalısınız. Verilerimiz, standart 4 saat luciferase gen transfeksiyon rejiminin, LY P uygulamasının yararını gösteren LY geçirgenliğini, TJ bariyer bütünlüğündeki değişiklikleri belirlemek için ölçülebilir bir şekilde değiştirmediğini göstermektedir.

Protocol

1.Genel hCMEC/D3 hücre kültürü Dondurulmuş hücrelerin resüsitasyonuNOT: Tüm hücre kültürü bakım ve deneyleri steril bir biyogüvenlik başlığı içinde yapılmıştır. Kültür ortamı, takviyeleri ve reaktifleri ya steril ürünler olarak satın alındı ya da mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için 0.22 μm membran filtre kullanılarak filtrasyon yoluyla sterilize edildi. Bir doku kültürü şişesine 8,5 mL kollajen çözeltisi (0,15mg/mL) ekleyin (75 cm2 <…

Representative Results

İlk olarak, TJ oluşumunun görünür kinetiklerini belirlemek için zaman diliminin LY geçirgenliği üzerindeki etkisini belirledik. 1. günden 10’a kadar olan ortalama LY Puygulama değerleri Şekil 2a’dagösterilmiştir. 1. günde, ortalama Puygulaması 4.25 x 10-4 cm/dk idi ve 2. Ortalama Puygulama değeri 3. Puygulama değerleri, 7. Puygulama değerle…

Discussion

BBB’nin önemli bir rolü, sinirsel mikroortamın hemostazını korumak için sistemik dolaşım ve beyin arasında gerekli olmayan iyonların ve toksik maddelerin değişimini önlemektir. BBB’nin karakteristik özelliklerinden biri, kapiller endotel hücrelerinin parasellüler taşıma rotasını etkili bir şekilde kapatan sıkı kavşaklar (TJs) oluşturabilme yeteneğidir. Kültürlü hCMEC/D3 monolayers TJ bariyer oluşumunun görünür kinetik belirlemek için nicel bir yöntem olarak bir LY Puygulaması</sub…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Amerikan Eczacılık Derneği’nin 2017 Yeni Araştırmacı Ödülü, Duquesne Üniversitesi’nden Hunkele Dreaded Disease ödülü ve Manickam laboratuvarı için Eczacılık Fakültesi’nin başlangıç fonlarından gelen mali destek için müteşekkirler. Biz sızıntı laboratuvarı (Duquesne Üniversitesi) batı bloting yardım ve onların Odyssey 16-bit görüntüleyici kullanımına izin için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Batı blotting ile ilgili yardım için Kandarp Dave (Manickam laboratuvarı) için takdir özel bir not eklemek istiyorum.

Materials

hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
  25. Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).

Tags

Keywords: Lucifer YellowParacellular PermeabilityBlood-brain BarrierCell ModelTight JunctionsApparent PermeabilityCell PlatingCollagen CoatingHCMEC/D3 CellsCell ConfluencyLucifer Yellow AssayTransport BufferFluorescence Measurement
check_url/it/58900?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow – A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image