Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas
Summary
Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.
Abstract
Análise da expressão da proteína no glioma é relevante para vários aspectos no estudo da sua patologia. Inúmeras proteínas têm sido descritas como biomarcadores com aplicações no diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Essas análises de biomarcadores também são úteis para caracterizar o tumor neurospheres (NS) gerados a partir de pacientes de glioma e modelos de glioma. Tumor NS fornecem um modelo valioso em vitro para avaliar diferentes características do tumor do qual eles são derivados e podem com mais precisão o espelho glioma biologia. Aqui nós descrevemos um método detalhado para analisar biomarcadores em tumor NS usando imuno-histoquímica (IHC) tumor de parafina NS.
Introduction
Gliomas são tumores sólidos primários do sistema nervoso central, classificadas por suas características fenotípicas e genotípicas de acordo com a Organização Mundial de saúde1. Esta classificação incorpora a presença ou ausência de mutações do motorista, que representam uma fonte atraente de biomarcadores2. Biomarcadores são características biológicas que podem ser medidas e avaliadas para indicar processos normais e patológicos, bem como respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica3. Biomarcadores podem ser detectados no tecido do tumor e células derivadas de glioma, permitindo a sua caracterização biológica em diferentes aspectos. Alguns exemplos de biomarcadores de glioma mutante isocitrato desidrogenase 1 (IDH1), uma enzima mutante característica de gliomas de baixo grau associadas a melhor prognóstico4. IDH1 mutado é expressa frequentemente em combinação com TP53 e síndrome de deficiência de alfa-talassemia/mental ligada ao X (ATRX)-Inactive mutações, definindo um glioma específico de subtipo4,5. ATRX-inactivar as mutações também ocorrem em 44% dos gliomas de alto grau pediátrica2,6 e têm sido associadas com tumores agressivos e instabilidade genômica6,7. Além disso, pediátricas gliomas Pontinas intrínsecas difusas (DIPG) são diferenciadas em subgrupos de acordo com a presença ou ausência de uma mutação K27M no gene de histona H3 H3F3A, ou no gene1,HIST1H3B/C6. Portanto, a introdução de caracterização molecular permite a subdivisão, estudo e tratamento de gliomas como entidades separadas, o que permitirá mais o desenvolvimento de mais direcionados a terapias para cada subtipo. Além disso, a análise de biomarcadores pode ser usada para avaliar diferentes processos biológicos, tais como apoptose8, autofagia9, de progressão do ciclo celular10, proliferação de célula11e diferenciação celular12 .
Modelos de animais geneticamente modificados que abrigam as lesões genéticas presentes em cânceres humanos são fundamentais para o estudo da sinalização de caminhos que medeiam a progressão da doença. Nosso laboratório implementou o uso do sistema de transposase beleza dormindo (SB) para desenvolver modelos de rato geneticamente modificados de glioma abrigando mutações específicas que recapitular glioma humano subtipos13,14. Estes modelos de rato geneticamente modificados são usados para gerar tumor derivado NS, que permitem estudos em vitro em um sistema 3D, espelhamento principais características presentes nos tumores in situ15. Além disso, o transplante de orthotopical de NS em ratos pode gerar tumores secundários que retêm características do tumor primário e imitam as propriedades fenotípicas, genômicas e histopatológicas do tumor primário correspondente15.
Em cultura livre de soro, células de tumor cerebral com propriedades de célula-tronco podem ser enriquecidas, e na presença de fatores de crescimento epidérmico (EGF) e fatores de crescimento do fibroblasto (FGF), eles podem ser crescidos como colônias única derivado de células, tais como culturas de NS. Neste sistema de cultura seletiva, a maioria das células de diferenciação ou diferenciados rapidamente morrer, Considerando que as células-tronco dividir e formar os grupos celulares. Isto permite a geração de uma cultura de NS que mantém glioma tumor características16,17,18. Glioma NS pode ser usado para avaliar diversos aspectos da biologia do tumor, incluindo a análise de biomarcadores que têm aplicações em diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Aqui, detalhamos um protocolo para gerar glioma NS e incorporar as culturas 3D em parafina a ser usado para coloração de IHC. Uma vantagem da fixação e incorporação de glioma NS é que a morfologia do NS é mantida melhor em comparação ao convencional cytospin método19, no qual glioma NS estão sujeitos à manipulação estressante para dissociação da célula em tornam-se achatados. Além disso, a incorporação sacia qualquer expressão de fluoróforo endógena de tumor geneticamente NS, permitindo que a coloração em todo o espectro fluorescente. O objectivo geral deste método é para preservar a estrutura 3D de células de glioma através de uma processo de incorporação de parafina e permitir a caracterização de glioma neurospheres usando imuno-histoquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, detalhamos um método versátil e pode ser reproduzido para realizar a imuno-histoquímica na parafina glioma NS, que mantêm a estrutura 3D característica de células de tumor crescendo no cérebro em situ. Esta técnica possui as seguintes vantagens sobre usando células chapeadas em vidro ou superfícies de plástico: eu) preservação da estrutura 3D do NS; II) evitando stress de dissociação de célula antes da análise da expressão da proteína; III) têmpera de qualquer expressão de fluo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National institutos de saúde nacional Instituto de doenças neurológicas & Stroke (NINDS/NIH) subvenções R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 para M.G.C.; NINDS/NIH concede R01-NS076991 e NS082311-R01 R01-NS096756 a P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; o departamento de neurocirurgia; Corações feliz da Leah M.G.C. e P.R.L.; e RNA biomedicina Grant F046166 para M.G.C. F.M.M. é suportado por um F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. foi apoiado por um argentino Fulbright Ministério do esporte e educação Fellowship.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
Riferimenti
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