Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Summary

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Abstract

Analyse de l’expression de la protéine dans les gliomes est pertinente pour plusieurs aspects dans l’étude de sa pathologie. Nombreuses protéines ont été décrits comme biomarqueurs avec des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ces analyses de biomarqueurs sont également utiles pour caractériser les tumeurs neurospheres (NS) produit de patients de gliome et modèles de gliome. NS de tumeur fournissent un modèle précieux in vitro pour évaluer les différentes caractéristiques de la tumeur d’où ils proviennent et peuvent mieux miroir gliome biologie. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour analyser des biomarqueurs dans la tumeur NS à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) sur tumeur paraffine NS.

Introduction

Les gliomes sont des tumeurs solides primaires du système nerveux central classées selon leurs caractéristiques phénotypiques et génotypiques selon l’ organisation mondiale de la santé¹. Cette classification comprend la présence ou l’absence de mutations de pilote, qui représentent une source attrayante de biomarqueurs². Biomarqueurs sont des caractéristiques biologiques qui peuvent être mesurés et évalués pour indiquer les processus normaux et pathologiques, ainsi que des réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique à³. Biomarqueurs peuvent être détectées dans les tissus tumoraux et cellules de gliome, ce qui permet sa caractérisation biologique sous différents aspects. Quelques exemples de biomarqueurs de gliome muté isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1), une enzyme mutante caractéristique des gliomes de bas-grade associés meilleur pronostic⁴. IDH1 muté s’exprime souvent en combinaison avec TP53 et alpha-thalassémie/mental retardation syndrome lié à le X (ATRX)-inactivation des mutations, définissant un gliome spécifique du sous-type^4,5. Mutations inactivant ATRX également se produisent dans 44 % des gliomes de haut grade pédiatriques^2,6 et ont été associées à des tumeurs agressives et instabilité génomique^6,7. En outre, pédiatriques diffus intrinsèques pontines gliomas (DIPG) sont différenciés en sous-groupes selon la présence ou l’absence d’une mutation de K27M dans le gène H3F3A de l’histone H3, ou dans le gène HIST1H3B/C^1,6. Par conséquent, l’introduction de la caractérisation moléculaire permet la subdivision, étude et le traitement des gliomes comme des entités distinctes, ce qui permettra le développement de plus de plus des traitements pour chaque sous-type ciblés. En outre, l’analyse de biomarqueurs peut servir à évaluer les différents processus biologiques tels que l’apoptose⁸autophagie⁹, cycle cellulaire progression¹⁰, cellule prolifération¹¹et la différenciation des cellules¹² .

Des modèles animaux issus du génie génétique qui hébergent les lésions génétiques présentes dans les cancers humains sont essentiels pour l’étude de la signalisation des voies qui véhiculent la progression de la maladie. Notre laboratoire a mis en place l’utilisation du système transposase Sleeping Beauty (SB) pour développer des modèles de souris génétiquement modifiées de gliome hébergeant des mutations spécifiques qui récapitulent gliome humain sous-types^13,14. Ces modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisées pour générer des dérivées de tumeurs NS, qui permettent des études in vitro dans un système 3D, mise en miroir des traits saillants présent dans les tumeurs in situ¹⁵. Aussi, la greffe d’orthotopical de NS chez la souris peut générer des tumeurs secondaires qui conservent les caractéristiques de la tumeur primitive et imitent les propriétés phénotypiques, génomiques et histopathologiques des tumeur primitive correspondante¹⁵.

Dans la culture sans sérum, cellules de tumeur du cerveau avec des propriétés de cellules souches peuvent être enrichies, et en présence de facteurs de croissance épidermiques (EGF) et facteurs de croissance fibroblastiques (FGF), ils peuvent être cultivés comme colonies de culture cellulaire unique comme cultures de NS. Dans ce système de culture sélective, la plupart des cellules de différenciation ou différenciées rapidement mourir, alors que les souches cellules se divisent et forment des amas cellulaires. Cela permet la génération d’une culture de NS qui maintient les gliomes tumeur caractéristiques^16,17,18. Gliome NS peut servir à évaluer plusieurs aspects de la biologie tumorale, y compris l’analyse de biomarqueurs qui ont des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ici, nous détaillons un protocole pour générer des gliomes NS et intégrer les cultures 3D en paraffine à utiliser pour la coloration de IHC. Un des avantages de la fixation et l’incorporation de gliome NS, c’est que la morphologie de la Nouvelle-Écosse est mieux maintenue par rapport au conventionnel cytospin méthode¹⁹, dans laquelle gliome NS sont soumis à des manipulations stressantes pour la dissociation cellulaire et deviennent aplaties. En outre, enrobage étanche toute expression de fluorophore endogène de tumeur génétiquement NS, ce qui permet une coloration dans les spectres de fluorescence. L’objectif général de cette méthode consiste à préserver la structure 3D des cellules de gliome par une paraffine intégrant les processus et permettre la caractérisation des gliomes neurospheres par immunohistochimie.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan. 1. génération de Brain Tumor Neurospheres provenant d’un modèle de souris Avant l’intervention de dissection, préparer des cellules souches neurales médias (Media NSC : DMEM/F12 avec 1 supplément de x B27, 1 x N2 supplément, 1 x normocin et 1 x antibiotique/antimycosiques additionné humaine recombinante EGF et basic-FGF ?…

Representative Results

Pour suivre le développement de tumeurs et d’évaluer si la tumeur a atteint la taille nécessaire pour générer les NS, nous avons analysé la luminescence émise par des tumeurs à l’aide de bioluminescence. Ceci permet l’étude de l’efficacité de la transduction dans les chiots et la progression tumorale par le signal de la luminescence de la luciférase (Figure 1A et 1 b). Lorsque la taille de la tumeur atteint…

Discussion

Dans cet article, nous détaillons une méthode reproductible et polyvalente pour exécuter immunohistochimie sur gliomes de paraffine NS, qui maintiennent la structure 3D caractéristique des cellules tumorales qui poussent dans le cerveau in situ. Cette technique possède les avantages suivants par rapport à l’aide de cellules plaqués sur les surfaces en plastique ou de verre : J’ai) la préservation de la structure 3D de la Nouvelle-Écosse ; II) en évitant de stress de dissociation cellulaire avant …

Materials

Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse