Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур
Summary
Neurospheres выращивают как 3D культур являются мощным инструментом для изучения биологии глиомы. Здесь мы представляем протокол для выполнения иммуногистохимия при сохранении 3D структура глиомы neurospheres через встраивание парафина. Этот метод позволяет характеристика глиомы нейросферы свойств, таких как stemness и нейронных дифференциации.
Abstract
Анализ выражения протеина в глиомы актуальна для ряда аспектов в изучении его патологии. Многочисленные белки были описаны как биомаркеров с приложениями в диагноз, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Эти анализы биомаркеров полезны также для характеристики опухоли neurospheres (NS) генерируется глиомы пациентов и глиомы модели. Опухоль NS обеспечивают ценный в vitro модель для оценки различных характеристик опухоли, из которого они являются производными и может более точно зеркало глиомы биологии. Здесь мы описываем метод подробный анализ биомаркеров в опухоли NS с помощью иммуногистохимия (IHC) на опухоли парафин врезанных NS.
Introduction
Глиомы являются первичных твердых опухолей центральной нервной системы, классифицируются по их Фенотипические и генотипические характеристики согласно Всемирной организации здравоохранения1. Эта классификация включает в себя наличие или отсутствие драйверов мутаций, которые представляют собой привлекательный источник биомаркеров2. Биомаркеры являются биологические характеристики, которые могут быть измерены и оценены для обозначения нормальных и патологических процессов, а также фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство3. Биомаркеры могут быть обнаружены в опухолевой ткани и клетки, полученные от глиомы, позволяя ее биологических характеристик в различных аспектах. Некоторые примеры глиомы крысы биомаркеров мутировавших isocitrate дегидрогеназа 1 (IDH1), мутант фермента, характерные для младших классов глиомы, связанные с лучше прогноза4. Мутировавшие IDH1 часто выражается в сочетании с TP53 и альфа талассемия/умственной отсталости синдром Х-хромосомой (ATRX)-инактивации мутации, определение конкретных глиомы подтип4,5. ATRX-инактивации мутации также происходят в 44% педиатрических полноценного глиомы2,6 и были связаны с агрессивными опухолями и геномная нестабильность6,7. Кроме того педиатрических диффузных встроенные Понтийские глиомы (DIPG) продифференцируйте в подгруппах по наличие или отсутствие K27M мутации гена гистонов H3 H3F3A, или HIST1H3B/C ген1,6. Таким образом, введение молекулярная характеристика разрешает подразделение, исследования и лечения глиомы как отдельные объекты, которые позволят более разработку более целенаправленных терапии для каждого подтипа. Кроме того анализ биомаркеров может использоваться для оценки различных биологических процессов, например апоптоз8, autophagy9, клеточный цикл прогрессии10, распространения клеток11и дифференцировки клеток12 .
Генетически модифицированные Животные модели, которые гавани генетических в человеческих раковых поражений являются критическими для изучения сигнальные пути, которые посредником прогрессирования заболевания. Наша лаборатория осуществляет использования системы Транспозаза Спящая красоты (SB) в разработке генетически модифицированные мыши модели глиомы, укрывательство специфических мутаций, которые пилки человека глиомы подтипы13,14. Эти генетически модифицированные мыши модели используются для генерации опухоль производные NS, которые позволяют в vitro исследования в системе 3D, зеркального отображения характерных особенностей присутствует в опухоли в situ15. Кроме того orthotopical трансплантация NS в мышей может генерировать вторичные опухоли, которые сохраняют особенности первичной опухоли и имитировать гистопатологические, геномных и фенотипических свойств соответствующей первичной опухоли15.
Сыворотка свободной культуры мозге опухолевых клеток со свойствами стволовых клеток может быть расширен, в присутствии эпидермальный фактор роста (EGF) и факторы роста фибробластов (ФБП), их можно выращивать как единый колоний клеток, полученных как NS культур. В этой системе выборочной культуры большинство дифференциации или дифференцированных клеток быстро умирают, тогда как стволовые клетки разделяют и формируют сотовой кластеров. Это позволяет генерации NS культуры, которая поддерживает глиомы опухоли особенности16,17,18. Глиомы NS может использоваться для оценки некоторых аспектов опухоли биологии, включая анализ биомаркеров, которые находят применение в диагностике, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Здесь, мы подробно протокол для создания глиомы NS и вставлять 3D культур в парафин используемый для окрашивания IHC. Одним из преимуществ установления и внедрения глиомы NS является, что морфология NS поддерживается лучше по сравнению с обычными cytospin метод19, в котором глиомы NS подвергаются стрессовым манипуляции для диссоциации клеток и стали плоскими. Кроме того внедрение утоляет любое выражение эндогенного Флюорофор от генетически опухоли NS, позволяя окрашивание через флуоресцентные спектров. Общая цель этого метода является сохранение 3D структура клеток глиомы через парафин, встраивание процесс и дать характеристику neurospheres глиомы, используя иммуногистохимия.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы подробно универсальным и воспроизводимый метод, чтобы выполнить иммуногистохимия на парафин врезанных глиомы NS, которые поддерживают характерным 3D структура клеток опухоли, растущие в мозг в situ. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с использовани…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) гранты R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 до M.G.C.; NIH/NINDS предоставляет R01-NS076991, R01-NS082311 и R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Кафедра нейрохирургии; Счастливые сердца Лии M.G.C. и P.R.L.; и РНК биомедицины Грант F046166 в M.G.C. F.M.M. поддерживается путем F31 NIH/NINDS-F31NS103500. Ю.П. была поддержана Фулбрайта-аргентинский Министерства спорта и образования стипендий.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
Riferimenti
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Ricerca sul cancro. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
