Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가
Summary
Neurospheres 3D 문화로 성장 glioma 생물학을 공부 하는 강력한 도구를 구성 합니다. 여기 선물이 immunohistochemistry 파라핀 포함 통해 glioma neurospheres의 3 차원 구조를 유지 하면서 수행 하는 프로토콜. 이 메서드는 stemness 등 신경 분화 glioma neurosphere 속성의 특성을 수 있습니다.
Abstract
Glioma에 단백질 발현의 분석은 여러 가지 측면의 병 리의 연구에 관련이 있습니다. 수많은 단백질 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램으로 설명 했습니다. 생체의 이러한 분석은 또한 종양 neurospheres (NS) glioma 환자 및 glioma 모델에서 생성 된 특성을 유용 합니다. 종양 NS 모델을 귀중 한 생체 외에서 평가는 그들이 파생 되 고 미러 glioma 생물학을 더 정확 하 게 수 있습니다 종양의 다른 기능을 제공 합니다. 종양 NS 바이오 마커 분석 하는 자세한 방법을 설명 여기에 파라핀 포함 종양 NS immunohistochemistry (IHC)를 사용 하 여.
Introduction
Gliomas 중추1세계 보건 기구 따르면 그들의 phenotypic genotypic 특성에 의해 분류의 기본 고체 종양입니다. 이 분류는 생체2의 매력적인 소스를 나타내는 드라이버 돌연변이의 유무를 통합 합니다. 생체 측정 하 고 치료 적 개입3약리 응답 뿐 아니라 정상 및 병 적인 프로세스를 나타내기 위해 평가 될 수 있는 생물 학적 특징입니다. 바이오 마커의 검출 될 수 있다 종양 조직에 셀 glioma에서 파생 된 다양 한 측면에서의 생물 학적 특성 사용. Glioma biomarkers의 몇 가지 예로 돌연변이 isocitrate 효소 1 (IDH1), 돌연변이 효소 더 나은 예 지4와 관련 된 낮은-학년 gliomas의 있습니다. IDH1 돌연변이 TP53 알파 thalassemia/정신 박약 증후군 X 연결 (ATRX)와 함께에서 자주 표현 된다-돌연변이 비활성화 특정 glioma 정의 하위4,5. ATRX 비활성화 돌연변이 또한 소아 고급 gliomas2,6 의 44%에서 발생 하 고 공격적인 종양 및 게놈 불안정성6,7관련 된 되었습니다. 또한, 소아 확산 본질적인 pontine gliomas (DIPG)는 히스톤 H3 유전자 H3F3A, 또는 HIST1H3B/C 유전자1,6K27M 돌연변이의 유무에 따라 하위 그룹에서 분화 된다. 따라서, 분자 특성의 소개 허용 세분, 연구, 그리고 더 더 개발 하면 별도 엔터티로 gliomas의 치료 대상으로 각 하위 형식에 대 한 치료. 또한, biomarkers의 분석 apoptosis8, autophagy9, 세포 주기 진행10, 셀 확산11, 세포 분화12 등 다른 생물 학적 과정을 평가에 사용할 수 있습니다. .
유전자 조작된 동물 모델 인간의 암 발생에 유전적 병 변의 항구는 질병의 진행을 중재 하는 통로 신호 하는 연구를 위한 중요 합니다. 우리의 실험실 glioma 은닉 인간의 glioma 하위13,14정리 특정 돌연변이의 유전자 조작된 마우스 모델 개발에 잠자는 아름다움 (SB) transposase 시스템의 사용을 구현 했습니다. 이러한 유전자 조작된 마우스 모델 3D 시스템에서 생체 외에서 연구는 종양에서 파생 된 NS를 생성 하는 데 사용 됩니다, 그리고 미러링 현저한 특징 종양에 원래의15에 제시. 또한, 쥐로 NS orthotopical 이식 1 차 종양의 기능을 유지 하 고 해당 기본 종양15의 histopathological, 게놈, 및 phenotypic 특성을 모방 하는 이차 종양을 생성할 수 있습니다.
혈 청 무료 문화에서 뇌 종양 세포 줄기 세포 특성을 가진 농축 될 수 있다, 그리고 표 피 성장 인자 (EGF)과 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF), 존재 그들은 NS 문화 등 단일 세포 유래 식민지로 성장 될 수 있다. 이 선택적 문화 시스템에 대부분 차별화 또는 차별화 된 세포 급속 하 게 죽어, 반면 줄기 세포 분열과 세포 클러스터 형성. NS 문화 glioma 종양 기능16,,1718유지를 생성 수 있습니다. Glioma NS 종양 생물학, 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램의 분석을 포함 한 여러 가지 측면을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 glioma NS를 생성 하 고 사용 되는 파라핀에 3D 문화를 포함 하는 프로토콜 세부 IHC 얼룩에 대 한. 담합 및 glioma NS 포함의 장점 중 하나는 NS의 형태는 유지 더 나은 기존의 cytospin 방법19, 어떤 glioma에서 NS 셀 분리에 대 한 스트레스가 조작에 복종 하 고 평평 하 게 될에 비해입니다. 또한, 유전자 조작된 종양 NS, 형광 스펙트럼에 걸쳐 얼룩 사용에서 생 fluorophore 식 냉각 포함. 이 방법의 전반적인 목표는 과정을 포함 한 파라핀 glioma 셀의 3 차원 구조를 유지 하 고 glioma neurospheres immunohistochemistry를 사용 하 여 특성을 사용 하입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는, 우리 선발 immunohistochemistry 파라핀 끼워 넣어진 glioma NS에 수행 하기 위해 다양 하 고 재현할 수 방법 두뇌 제자리에서 성장 하는 종양 세포의 특성 3 차원 구조를 유지 하는. 이 기술은 유리 또는 플라스틱 표면에 도금 하는 셀을 사용 하 여 다음과 같은 이점을: 난) NS;의 3D 구조의 보존 ii) 단백질 표정;의 분석 하기 전에 셀 분리의 스트레스의 방지 3) 유전자 조작된 종양 NS, 사?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 보조금 R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 M.G.C.;에 의해 지원 되었다 NIH/NINDS 부여 R01-NS076991, R01-NS082311, 및 R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; 신경외과 학과; 레 아의 행복 한 마음은 M.G.C. 및 P.R.L.; 그리고 RNA 의학 그랜트 F046166 M.G.C. F.M.M.에 의해 한 F31 NIH/NINDS-F31NS103500 지원 됩니다. Jp 모 간 풀브라이트 아르헨티나 스포츠 사역 및 교육 협력에 의해 지원 되었다.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
Riferimenti
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