Evaluering av Biomarkers i Glioma av immunhistokjemi på parafin-Embedded 3D Glioma Neurosphere kulturer
Summary
Neurospheres dyrket som 3D kulturer utgjør et kraftig verktøy for å studere glioma biologi. Her presenterer vi en protokoll for å utføre immunohistochemistry samtidig 3D oppbygning glioma neurospheres gjennom parafininnstøper. Denne metoden kan karakterisering av glioma neurosphere egenskaper som stemness og nevrale differensiering.
Abstract
Analyse av protein uttrykk i glioma er relevant for flere aspekter i studiet av dens patologi. Mange proteiner har blitt beskrevet som biomarkers programmer diagnose, prognosen, klassifisering, delstaten svulst progresjon og celle differensiering tilstand. Disse analysene av biomarkers er også nyttig å karakterisere svulst neurospheres (NS) fra glioma pasienter og glioma modeller. Svulst NS gi en verdifull i vitro modell for å vurdere ulike funksjoner av svulsten som de er avledet og kan mer nøyaktig speil glioma biologi. Her beskriver vi en detaljert metode for å analysere biomarkers i svulst NS med immunohistochemistry (IHC) på parafin-embedded svulst NS.
Introduction
Gliomas er primære solide svulster i sentralnervesystemet klassifisert av deres fenotypiske og genotypic egenskaper i henhold til Verdens helseorganisasjon1. Klassifiseringen inkluderer tilstedeværelse eller fravær av driveren mutasjoner, som representerer en attraktiv kilde biomarkers2. Biomarkers er biologiske egenskaper som kan måles og evalueres for å indikere normal og patologisk prosesser, samt farmakologiske svar til terapeutisk intervensjon3. Biomarkers kan oppdages i tumor vev og celler avledet fra glioma, slik at dens biologiske karakteristikk i ulike aspekter. Eksempler på glioma biomarkers er muterte isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1), en mutert enzym karakteristisk for lavere grad gliomas assosiert med bedre prognose4. Muterte IDH1 uttrykkes ofte i kombinasjon med TP53 og alpha-talassemi/mental retardasjon syndrom X-koblet (ATRX)-inaktivere mutasjoner, definere en bestemt glioma undertype4,5. ATRX-inaktivere mutasjoner også forekommer i 44% av pediatric høyverdig gliomas2,6 og er forbundet med aggressiv svulster og genomisk ustabilitet6,7. I tillegg er pediatric diffus iboende pontine gliomas (DIPG) differensiert i undergrupper etter tilstedeværelse eller fravær av en K27M mutasjon histone H3 genet H3F3A eller HIST1H3B/C gen1,6. Derfor innføringen av molekylære karakterisering tillater underinndeling, studiet og behandling av gliomas som separate enheter, noe som gjør mer utvikling av mer målrettet terapi for hver undertype. I tillegg kan analyse av biomarkers brukes til å evaluere ulike biologiske prosesser som apoptose8, autophagy9, celle syklus progresjon10, celle spredning11og celledifferensiering12 .
Genmodifiserte dyr modeller som havn genetisk lesjoner i kreft hos mennesker er avgjørende for å studere signalnettverk trasé som megle sykdomsprogresjon. Vårt laboratorium har implementert bruk av Sleeping Beauty (SB) transposase systemet å utvikle genmodifiserte musen modeller av glioma skjuler spesifikke mutasjoner som recapitulate menneskelige glioma subtyper13,14. Modellene genmodifiserte mus brukes for å generere svulst-avledet NS, som aktiverer i vitro studier i et 3D-system, speiling viktigste funksjonene finnes i svulster i situ15. Orthotopical transplantasjon av NS i mus kan også generere sekundære svulster som beholde funksjoner av den primære svulsten og etterligner egenskapene histopathological genomisk og fenotypiske av tilsvarende primære svulst15.
I serum-free kultur, hjerne svulst cellene med stilk celleegenskaper kan bli beriket, og i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast vekstfaktorer (FGF), de kan dyrkes som enkelt celle-avledet kolonier som NS kulturer. I dette selektiv kultur-systemet dør mest unike eller differensierte celler raskt, mens stilk celler dele og danne mobilnettet klynger. Dette tillater generering av en NS kultur som opprettholder glioma svulst funksjoner16,17,18. Glioma NS kan brukes til å vurdere flere aspekter av svulst biologi, inkludert analyse av biomarkers som har programmer i diagnose, prognosen, klassifisering, delstaten svulst progresjon og celle differensiering tilstand. Her vi detalj en protokoll for å generere glioma NS og bygg inn 3D kulturer i parafin skal brukes til IHC farging. En fordel av bestemmer og innebygging glioma NS er at morfologi av NS opprettholdes bedre sammenlignet med konvensjonelle cytospin metoden19, som glioma NS er utsatt for stressende manipulasjon for cellen dissosiasjon og bli jevnet. I tillegg slukker innebygging alle endogene fluorophore uttrykk fra genmodifiserte svulsten NS, aktivere flekker over til fluorescerende spectra. Det overordnede målet med denne metoden er å bevare 3D strukturen av glioma celler gjennom en parafin innebygging prosessen og aktiverer karakterisering av glioma neurospheres med immunohistochemistry.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen detalj vi en allsidig og reproduserbar metode for å utføre immunohistochemistry på parafin-embedded glioma NS, som opprettholde karakteristiske 3D strukturen av kreftceller vokser i hjernen i situ. Denne teknikken har følgende fordeler over bruker celler belagt på glass eller plast overflater: jeg) bevaring av 3D NS; II) å unngå stress av cellen dissosiasjon før analyse av protein uttrykk. III) slukke alle endogene fluorophore uttrykk fra genmodifiserte svulsten NS, aktivere flekker ov…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse/National Institute av nevrologiske lidelser og slag (NIH/NINDS) tilskudd R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 å M.G.C.; NIH/NINDS gir R01-NS076991, R01-NS082311 og R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Department of Neurosurgery; Leah Happy Hearts M.G.C. og P.R.L.; og RNA biomedisin Grant F046166 å M.G.C. F.M.M. støttes av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. ble støttet av et Fulbright-argentinsk departementet av idrett og utdanning fellesskap.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
Riferimenti
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Ricerca sul cancro. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
