Agrobacterium tumefaciens och Agrobacterium rhizogenes-medierad omvandling av potatis och en Suberin gen av GUS Staining arrangören aktivitet

Summary

Här presenterar vi två protokoll för att omvandla potatisplantor. Agrobacterium tumefaciens omvandling leder till en komplett transgena anläggning medan den Agrobacterium rhizogenes producerar transgena håriga rötter i en vildtyp skjuta som kan själv förökade. Vi upptäcker då arrangören aktivitet av GUS färgning i de transformerade rötterna.

Abstract

Agrobacterium sp. är en av de mest använda metoderna för att erhålla transgena växter har förmågan att överföra och integrera sina egna T-DNA i växtens arvsmassa. Här presenterar vi två omvandling system för att genetiskt modifiera potatisplantor (Solanumtuberosum). I A. tumefaciens förvandling, bladen är smittade, de transformerade cellerna väljs och en ny komplett bearbetade anläggning regenereras med fytohormoner i 18 veckor. I A. rhizogenes förvandling, stjälkar är smittade genom att injicera bakterier med en nål, nytt framkommit transformerad hårig rötterna upptäcks med en röd fluorescerande markör och icke-omvandlad rötter tas bort. I 5-6 veckor är resulterande anläggningen sammansatt av en vildtyp skjuta med fullt utvecklad transformerad håriga rötter. För att öka biomassa, kan omvandlas hårig rötterna censurerade och själv förökat. Vi ansökte båda Agrobacterium –medierad omvandling metoder för att få rötter uttrycker GUS reporter genen drivs av suberin biosyntetiska gen främjare. De GUS färgningsproceduren tillhandahålls och tillåter cell lokaliseringen av promotorn induktionen. I båda metoderna visade transformerad potatis rötterna GUS färgning i suberized Endodermisen och exodermis, och dessutom i A. rhizogenes omvandlas rötter aktiviteten GUS upptäcktes också i uppkomsten av laterala rötter. Dessa resultat tyder på att A. rhizogenes kan vara ett snabbt alternativa verktyg att studera gener som uttrycks i rötter.

Introduction

Bortsett från ekonomiska intresse har generering av transgena växter sin egen betydelse i forskning att demonstrera den ultimata funktionen av gener och att bättre förstå växtfysiologi och utveckling. Mest använda metoden för växt DNA införande är Agrobacterium-medierad omvandling. Agrobacterium tumefaciens är kunna generera crown galls i vävnaden som har infekterats av många växtarter av dess tumör-inducerande (Ti) plasmid. Plasmiden innehåller en T-DNA region med en uppsättning gener som kommer att integreras i växten genomet och inducera vävnad dedifferentiering^1,2. Utbyte av dessa gener inom T-DNA av transgenens har tillåtit generationen av särskilda växt ändringar att undvika fenotypisk effekter³. För att underlätta den transgenens kloning i T-DNA, regionen T-DNA har varit censurerade i en oberoende plasmid som kallas ett binärt plasmid, medan resten av generna av Ti plasmiden (de virulensgener som gör T-DNA överföring och insättning mekanismerna) har varit placeras i en helper plasmid. För bioteknik växtforskning omvandling av A. tumefaciens har flera fördelar: det behöver inte dyra enheter, kan generera både stabil och övergående växt förvandling och lågt antal gene kopior är integrerade i den kromosom⁴. Men för de flesta växter, men inte, Arabidopsis kräver generering av stabila transformants anläggningen förnyelse från en enda eller ett fåtal celler använder exogent fytohormoner, att göra denna process mödosam och tidskrävande. A. rhizogenes är också kunna ändra växt genomet, producerar håriga rötter eller oavsiktlig rötter på infektion platser på grund av uttrycket av rol (roten loci) gener kodade i rot-inducerande (Ri) plasmid⁵. Även om mindre studerade än A. tumefaciens, används A. rhizogenes också för att erhålla transgena rötter. I det här fallet innehåller den A. rhizogenes den ursprungliga T-DNA i Ri plasmiden och ett binärt plasmid med en andra T-DNA bär transgenens. När webbplatsen infektion är i stjälkar eller hypocotyls, kan en komposit växt erhållas, med nya hårig transgena rötter framväxande från vildtyp skott. Alternativt kan hårig transformerad rötter växa självständigt i vitro i media med kol källa ingångar. Användning av A. rhizogenes istället för A. tumefaciens att producera transgena vävnad vinner relevans när roten är målorganet, eftersom växten förnyelse krävs inte och därför är det snabbare och mindre kostsamma. Tidigare studier har visat denna metod som disponeras för fenotypisk karakterisering av roten specifika gener^6,7,8,9.

Potatis (Solanumtuberosum) är den fjärde viktigaste grödan i världen enligt livsmedels- och jordbruksorganisation av FN (FAO) eftersom knölen har näringsmässiga betydelse livsmedel för att vara en bra källa av vitaminer och mineraler. Därför potatis har placerats i strålkastarljuset i jordbruket bioteknik och också anses som en bra biologisk modell för genetiska och utvecklingstoxikologiska studier^10,11. Potatis omvandling väsentligt bidragit till förståelsen av molekylära mekanismerna underliggande suberized vävnader genom karakterisering av gener involverade i suberin och vax biosyntes^{12,13,14 ,15,16,17}, suberin monomer transport¹⁸ och transkription förordning¹⁹. Suberin feruloyl transferas gen, FHT, är en av dessa kännetecknas biosyntetiska gener; dess nedreglering ger upphov till en stark nedsättning av periderm skyddet som är korrelerad med en stark minskning ferulate estrar av suberin och vaxer i potatis knölar¹⁴. Samtidigt, i rötter och frön av Arabidopsis visade knockout av dess förmodade orthologue (ASFT/RWP1) också sin roll i producerande alkyl ferulates i suberin^20,21. I potatis visade FHT transkriptionell reporter linjen och FHT antikroppen respektive att aktiviteten Promotorn och proteinet är placerade i Exodermisen, Endodermisen, phellogen-derivat och sårade vävnader¹⁵.

I detta arbete detalj vi ett protokoll med A. rhizogenes att producera transgena håriga rötter som underhålls i ett vildtyps-shoot, generera sammansatta potatisplantor eller exciderad växa självständigt in vitro. Vi ger också protokollet använder A. tumefaciens för att erhålla fullständig transgena potatisplantor. Som en fallstudie används A. rhizogenes och A. tumefaciens omvandlas med samma binära vektorn att få rötter med FHT arrangören kör GUS reporter genuttryck. Resultaten rapporteras och jämfört.

Protocol

A. rhizogenes transformation protokollet var anpassas och ändras från Horn et al.7 och den genotyp som testade var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). A. tumefaciens omvandling protokollet var anpassas och ändras från Banerjee et al.22 och de genotyper som testade var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) och S. tuberosum ssp. andigena. De viktigaste stegen i båda förfarandena samma…

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes -medierad potatis transformation I detta manuskript presenteras det stegvisa förfarandet ställa in att få transformerade rot med A. rhizogenes . Figur 1 presenterar en översikt av förfarandet, som helt och hållet tar omkring 5-6 veckor (injektion av A. rhizogenes att erhålla fullt utvecklad håriga rötter)….

Discussion

I potatis använder det vanligaste systemet att få stabil komplett transgena växter omvandlingen av Agrobacterium tumefaciens stammar som kräver organogenesen använder exogent fytohormoner. Även om de Agrobacterium baserat protokoll har potential att integrera icke-T-DNA vektor sekvens²⁵, finns denna metod fortfarande det enklaste och billigare att omvandla potatisplantor. Under senaste åren har intresset för A. rhizogenes-medierad omvandling har fått uppmärksam…

Materials

Acetone	Panreac	1.310.071.21
Acetosyringone	Acros	115540050
Aquarium pump	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Bacteriological agar	Lab Conda	1800
BAP	Duchefa	B0904
Beef extract	Lab Conda	1700
Plant growing cabinet	Nuaire
Carbenicillin	Duchefa	C0109
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Ethanol	Merck	1,009,831,011
Falcon tube	Control tecnica	CFT011500
Ferricyanate	Sigma	101001081
Ferrocyanate	Sigma	100979088
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamycin	Sigma	K1377
Leukopor tape	BSN Leukopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Magnetic shaker	Agimatic	7000243
MES hydrate	Sigma	M2933-25G
MgSO4	Panreac	131404
Microscope	Olympus
Minufugue centrifugue 5415R	Eppendorf
Murashige and Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na2HPO4	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH2PO4	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm	Anorsa	PRFL-001-001
Peptone	Lab Conda	1616
Petri dishes (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison
Phytotron	Inkoa	RFTI-R5485
Plant Agar	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicin	Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Spectrophotometer	Shimadzu
Square plates (120 x 120)	Deltalab	200204
Streptomycin	Sigma	S6501
Sucrose	Panreac	131621
Surgical blades	Swann-Morton	201
Surgical needle	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 shaker	Heidolph
Vacuum	Dinko
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)	Biosynth	B-7398
Yeast extract	Lab Conda	1702.00
Zeatin riboside	Sigma	1001042850