Här presenterar vi två protokoll för att omvandla potatisplantor. Agrobacterium tumefaciens omvandling leder till en komplett transgena anläggning medan den Agrobacterium rhizogenes producerar transgena håriga rötter i en vildtyp skjuta som kan själv förökade. Vi upptäcker då arrangören aktivitet av GUS färgning i de transformerade rötterna.
Agrobacterium sp. är en av de mest använda metoderna för att erhålla transgena växter har förmågan att överföra och integrera sina egna T-DNA i växtens arvsmassa. Här presenterar vi två omvandling system för att genetiskt modifiera potatisplantor (Solanumtuberosum). I A. tumefaciens förvandling, bladen är smittade, de transformerade cellerna väljs och en ny komplett bearbetade anläggning regenereras med fytohormoner i 18 veckor. I A. rhizogenes förvandling, stjälkar är smittade genom att injicera bakterier med en nål, nytt framkommit transformerad hårig rötterna upptäcks med en röd fluorescerande markör och icke-omvandlad rötter tas bort. I 5-6 veckor är resulterande anläggningen sammansatt av en vildtyp skjuta med fullt utvecklad transformerad håriga rötter. För att öka biomassa, kan omvandlas hårig rötterna censurerade och själv förökat. Vi ansökte båda Agrobacterium –medierad omvandling metoder för att få rötter uttrycker GUS reporter genen drivs av suberin biosyntetiska gen främjare. De GUS färgningsproceduren tillhandahålls och tillåter cell lokaliseringen av promotorn induktionen. I båda metoderna visade transformerad potatis rötterna GUS färgning i suberized Endodermisen och exodermis, och dessutom i A. rhizogenes omvandlas rötter aktiviteten GUS upptäcktes också i uppkomsten av laterala rötter. Dessa resultat tyder på att A. rhizogenes kan vara ett snabbt alternativa verktyg att studera gener som uttrycks i rötter.
Bortsett från ekonomiska intresse har generering av transgena växter sin egen betydelse i forskning att demonstrera den ultimata funktionen av gener och att bättre förstå växtfysiologi och utveckling. Mest använda metoden för växt DNA införande är Agrobacterium-medierad omvandling. Agrobacterium tumefaciens är kunna generera crown galls i vävnaden som har infekterats av många växtarter av dess tumör-inducerande (Ti) plasmid. Plasmiden innehåller en T-DNA region med en uppsättning gener som kommer att integreras i växten genomet och inducera vävnad dedifferentiering1,2. Utbyte av dessa gener inom T-DNA av transgenens har tillåtit generationen av särskilda växt ändringar att undvika fenotypisk effekter3. För att underlätta den transgenens kloning i T-DNA, regionen T-DNA har varit censurerade i en oberoende plasmid som kallas ett binärt plasmid, medan resten av generna av Ti plasmiden (de virulensgener som gör T-DNA överföring och insättning mekanismerna) har varit placeras i en helper plasmid. För bioteknik växtforskning omvandling av A. tumefaciens har flera fördelar: det behöver inte dyra enheter, kan generera både stabil och övergående växt förvandling och lågt antal gene kopior är integrerade i den kromosom4. Men för de flesta växter, men inte, Arabidopsis kräver generering av stabila transformants anläggningen förnyelse från en enda eller ett fåtal celler använder exogent fytohormoner, att göra denna process mödosam och tidskrävande. A. rhizogenes är också kunna ändra växt genomet, producerar håriga rötter eller oavsiktlig rötter på infektion platser på grund av uttrycket av rol (roten loci) gener kodade i rot-inducerande (Ri) plasmid5. Även om mindre studerade än A. tumefaciens, används A. rhizogenes också för att erhålla transgena rötter. I det här fallet innehåller den A. rhizogenes den ursprungliga T-DNA i Ri plasmiden och ett binärt plasmid med en andra T-DNA bär transgenens. När webbplatsen infektion är i stjälkar eller hypocotyls, kan en komposit växt erhållas, med nya hårig transgena rötter framväxande från vildtyp skott. Alternativt kan hårig transformerad rötter växa självständigt i vitro i media med kol källa ingångar. Användning av A. rhizogenes istället för A. tumefaciens att producera transgena vävnad vinner relevans när roten är målorganet, eftersom växten förnyelse krävs inte och därför är det snabbare och mindre kostsamma. Tidigare studier har visat denna metod som disponeras för fenotypisk karakterisering av roten specifika gener6,7,8,9.
Potatis (Solanumtuberosum) är den fjärde viktigaste grödan i världen enligt livsmedels- och jordbruksorganisation av FN (FAO) eftersom knölen har näringsmässiga betydelse livsmedel för att vara en bra källa av vitaminer och mineraler. Därför potatis har placerats i strålkastarljuset i jordbruket bioteknik och också anses som en bra biologisk modell för genetiska och utvecklingstoxikologiska studier10,11. Potatis omvandling väsentligt bidragit till förståelsen av molekylära mekanismerna underliggande suberized vävnader genom karakterisering av gener involverade i suberin och vax biosyntes12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 och transkription förordning19. Suberin feruloyl transferas gen, FHT, är en av dessa kännetecknas biosyntetiska gener; dess nedreglering ger upphov till en stark nedsättning av periderm skyddet som är korrelerad med en stark minskning ferulate estrar av suberin och vaxer i potatis knölar14. Samtidigt, i rötter och frön av Arabidopsis visade knockout av dess förmodade orthologue (ASFT/RWP1) också sin roll i producerande alkyl ferulates i suberin20,21. I potatis visade FHT transkriptionell reporter linjen och FHT antikroppen respektive att aktiviteten Promotorn och proteinet är placerade i Exodermisen, Endodermisen, phellogen-derivat och sårade vävnader15.
I detta arbete detalj vi ett protokoll med A. rhizogenes att producera transgena håriga rötter som underhålls i ett vildtyps-shoot, generera sammansatta potatisplantor eller exciderad växa självständigt in vitro. Vi ger också protokollet använder A. tumefaciens för att erhålla fullständig transgena potatisplantor. Som en fallstudie används A. rhizogenes och A. tumefaciens omvandlas med samma binära vektorn att få rötter med FHT arrangören kör GUS reporter genuttryck. Resultaten rapporteras och jämfört.
I potatis använder det vanligaste systemet att få stabil komplett transgena växter omvandlingen av Agrobacterium tumefaciens stammar som kräver organogenesen använder exogent fytohormoner. Även om de Agrobacterium baserat protokoll har potential att integrera icke-T-DNA vektor sekvens25, finns denna metod fortfarande det enklaste och billigare att omvandla potatisplantor. Under senaste åren har intresset för A. rhizogenes-medierad omvandling har fått uppmärksam…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant till PB), Ministerio de Economía y Competitividad och FEDER finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) och den universitet Girona (PhD stipendium till SF och grant SING11/1). Författarna är tacksamma till Dr Inge Broer (Institutet för markanvändning, universitetar av Rostock, Rostock, Tyskland) och Dr Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) för att tillhandahålla den A. rhizogenes och A. tumefaciens stam, respektive, och Dr Marçal Soler och Dr Anna Plasencia för hjälp och stöd som fick inleda A. rhizogenes transformation experimenten (Toulouse III Paul Sabatier universitet — CNRS, växt forskning laboratorium (LRSV), Castanet Tolosan, Frankrike). Författarna tackar Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) för hennes värdefulla bistånd vid genomförande av laboratoriearbetet och skötsel av växter, och Ferran Fontdecaba och Carla Sánchez som bistod med några av experiment medan de gjorde deras slutliga examensarbeten.
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
Microscope |
Olympus |
||
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
pHmetre |
Crison |
||
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
Vacuum |
Dinko |
||
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |