Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining

Summary

Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.

Abstract

Agrobacterium sp. is één van de meest gebruikte methoden voor het verkrijgen van transgene planten als het heeft de mogelijkheid om te dragen en de plant genoom te integreren in de eigen T-DNA. Hier presenteren we twee transformatie systemen om genetisch wijzigen aardappelplanten (Solanum tuberosum). In A. tumefaciens transformatie, bladeren zijn besmet, getransformeerde cellen worden geselecteerd en een nieuwe volledige getransformeerde fabriek wordt geregenereerd fytohormonen met 18 weken. In A. rhizogenes transformatie, stengels zijn besmet door het injecteren van de bacteriën met een naald, de nieuwe getransformeerd naar voren gekomen harige wortels worden gedetecteerd met behulp van een rode fluorescerende markering en de wortels niet-getransformeerd worden verwijderd. In 5-6 weken is de resulterende plant een composiet van een wild type shoot met volledig ontwikkelde getransformeerde harige wortels. Het vergroten van de biomassa, kunnen de getransformeerde harige wortels worden weggesneden en zelf doorgegeven. We beide Agrobacterium –gemedieerde transformatie methoden om te verkrijgen van de wortels die de GUS verslaggever-gen uitdrukt gedreven door een promotor van suberine biosynthetic gene toegepast. De GUS kleuring procedure wordt verstrekt en laat de lokalisatie van de cel van de inductie van de promotor. In beide methoden toonde de getransformeerde aardappel wortels vlekken in de suberized endodermis en exodermis, en bovendien, in de A. rhizogenes getransformeerd wortels de activiteit GUS GUS is ook aangetroffen in de opkomst van laterale wortels. Deze resultaten suggereren dat A. rhizogenes een snel alternatief instrument te bestuderen van de genen die worden uitgedrukt in wortels kan zijn.

Introduction

Afgezien van economisch belang heeft de generatie van transgene planten zijn eigen belang in onderzoek om aan te tonen de ultieme functie van genen en plantenfysiologie en ontwikkeling beter te begrijpen. De meest gebruikte methode voor plant DNA invoeging Agrobacterium is-gemedieerde transformatie. Agrobacterium tumefaciens vermag kroon kurkachtig genereren in de geïnfecteerde weefsel van vele plantensoorten door de inwerking van de tumor-inducerende (Ti) plasmide. Het plasmide bevat een T-DNA-regio met een aantal genen die zullen worden geïntegreerd in het genoom van de plant en het veroorzaken van weefsel dedifferentiation^1,2. De uitwisseling van deze genen binnen de T-DNA door de transgenic heeft de generatie van specifieke plant wijzigingen vermijden van fenotypische effecten³toegestaan. Om te vergemakkelijken de transgenic klonen in de T-DNA, heeft de regio van T-DNA is weggesneden in een onafhankelijke plasmide genoemd een binaire plasmide, terwijl de rest van de genen van de Ti-plasmide (de virulentiegenen waarmee de mechanismen voor overdracht en inbrengen van T-DNA) geweest Geplaatst in een plasmide helper. Voor plant biotechnologisch onderzoek, transformatie door A. tumefaciens heeft verschillende voordelen: het heeft geen behoefte aan dure apparaten, is in staat om zowel stabiel en voorbijgaande plant transformatie, als lage aantallen van gen exemplaren zijn geïntegreerd in de chromosoom⁴. De generatie van stabiele transformants vereist echter voor de meeste planten, maar niet, Arabidopsis plant regeneratie van één of een paar cellen met behulp van exogene fytohormonen, waardoor dit proces moeizaam en tijdrovend. A. rhizogenes is ook kundig voor wijzigen van het genoom van de plant, produceren harige wortels of bijwortels op de sites van de infectie als gevolg van de expressie van genen van de rol (wortel loci) gecodeerd in de root-inducerende (Ri) plasmide⁵. Hoewel minder dan A. tumefaciensstudeerde, wordt A. rhizogenes ook gebruikt voor het verkrijgen van transgene wortels. In dit geval, bevat de A. rhizogenes het oorspronkelijke T-DNA in het plasmide Ri en een binaire plasmide met een tweede T-DNA die de transgenic. Wanneer de infectie-site in stengels of hypocotyls is, kan een samengestelde plant worden verkregen, met nieuwe harige transgene wortels opkomende van wild type schiet. Als alternatief, harige getransformeerde wortels kunnen groeien autonoom in vitro in media met koolstof bronaanvoeren. Het gebruik van A. rhizogenes in plaats van A. tumefaciens voor de productie van transgene weefsel wint relevantie als de hoofdmap de doel-orgel, is vanwege de regeneratie van de plant is niet vereist en vandaar het is sneller en minder kostbaar. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze methode uitgetrokken voor de fenotypische karakterisering van wortel specifieke genen^6,7,8,9.

De aardappel (Solanum tuberosum) is de vierde belangrijkste gewas in de wereld volgens de voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties (FAO), omdat de Knol voeding relevantie voor menselijke consumptie voor het zijn een goede bron van vitaminen en mineralen. Om die reden, aardappel in de schijnwerpers van landbouwkundige biotechnologie is gezet en ook wordt beschouwd als een goede biologische model voor genetische en ontwikkelingsbiologie^{10,11 bestudeert}. Aardappel transformatie in belangrijke mate bijgedragen aan het begrip van de moleculaire mechanismen onderliggende suberized weefsels via de karakterisatie van genen betrokken bij suberine en wax biosynthese^{12,13,14 ,15,16,17}, suberine monomeer vervoer¹⁸ en transcriptie verordening¹⁹. Het suberine feruloyl transferase gen, FHT, behoort tot deze gekarakteriseerd biosynthetic genen; haar Downregulatie geeft aanleiding tot een sterke aantasting van de bescherming van de periderm, die is gecorreleerd met een sterke afname van de ferulate esters van suberine en wassen in aardappel knollen¹⁴. Gelijktijdig, in de wortels en zaden van Arabidopsis, de knock-out van haar vermeende orthologue (ASFT/RWP1) ook blijk gegeven van haar rol in het produceren van alkyl ferulates in suberine^20,21. In aardappel toonde de FHT transcriptionele verslaggever lijn en het antilichaam FHT respectievelijk dat de promotor-activiteit en het eiwit zich in de exodermis, de endodermis, de phellogen-derivaten en gewonde weefsels^{15 bevinden}.

In dit werk detailleren wij een protocol met behulp van A. rhizogenes voor de productie van transgene harige wortels die worden bijgehouden in een wild type shoot, het genereren van samengestelde aardappelplanten of weggesneden om te groeien autonoom in vitro. We bieden ook het protocol dat A. tumefaciens gebruikt om volledige transgene aardappelplanten. Als een case-studie, worden A. rhizogenes en A. tumefaciens getransformeerd met de dezelfde binaire vector gebruikt voor het verkrijgen van de wortels met de promotor van de FHT GUS verslaggever genexpressie rijden. De resultaten worden gerapporteerd en vergeleken.

Protocol

Het A. rhizogenes -transformatie-protocol werd aangepast en gewijzigd van Horn et al.7 en het genotype getest was S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). Het A. tumefaciens transformatie protocol werd aangepast en gewijzigd van Banerjee et al.22 en de genotypen getest werden S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) en S. tuberosum ssp. andigena. De belangrijkste stappen van beide procedures word…

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes -gemedieerde aardappel transformatie In dit manuscript, de stapsgewijze procedure instellen om te verkrijgen getransformeerd wortel met A. rhizogenes gepresenteerd. Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure, waarin in totaal ongeveer 5-6 weken (na injectie van A. rhizogenes voor het verkrijgen van de volledig o…

Discussion

In aardappel, het meest voorkomende systeem voor stabiele volledige transgene planten gebruikt de transformatie door Agrobacterium tumefaciens stammen waarvoor organogenese gebruik van exogene fytohormonen. Hoewel de Agrobacterium gebaseerde protocollen heeft het potentieel om het integreren van niet-T-DNA vector reeks²⁵, is deze methode nog het makkelijkst en minder dure beschikbaar voor transformeren aardappelplanten. Tijdens de laatste jaren de belangstelling voor A. rhizo…

Materials

Acetone	Panreac	1.310.071.21
Acetosyringone	Acros	115540050
Aquarium pump	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Bacteriological agar	Lab Conda	1800
BAP	Duchefa	B0904
Beef extract	Lab Conda	1700
Plant growing cabinet	Nuaire
Carbenicillin	Duchefa	C0109
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Ethanol	Merck	1,009,831,011
Falcon tube	Control tecnica	CFT011500
Ferricyanate	Sigma	101001081
Ferrocyanate	Sigma	100979088
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamycin	Sigma	K1377
Leukopor tape	BSN Leukopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Magnetic shaker	Agimatic	7000243
MES hydrate	Sigma	M2933-25G
MgSO4	Panreac	131404
Microscope	Olympus
Minufugue centrifugue 5415R	Eppendorf
Murashige and Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na2HPO4	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH2PO4	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm	Anorsa	PRFL-001-001
Peptone	Lab Conda	1616
Petri dishes (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison
Phytotron	Inkoa	RFTI-R5485
Plant Agar	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicin	Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Spectrophotometer	Shimadzu
Square plates (120 x 120)	Deltalab	200204
Streptomycin	Sigma	S6501
Sucrose	Panreac	131621
Surgical blades	Swann-Morton	201
Surgical needle	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 shaker	Heidolph
Vacuum	Dinko
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)	Biosynth	B-7398
Yeast extract	Lab Conda	1702.00
Zeatin riboside	Sigma	1001042850