Summary
In vivo hos däggdjur modeller av kritiska och medelstora ben defekter är väsentliga för forskare som studerar läkande mekanismer och ortopediska behandlingar. Här introducerar vi ett protokoll för skapandet av reproducerbara, segmentell, femorala defekter hos råttor stabiliserad med extern fixering.
Abstract
Ortopedisk forskning är starkt beroende av djurmodeller att studera mekanismer av ben helande i vivo samt undersöka de nya behandlingstekniker. Kritisk och medelstora segmentella defekter är utmanande för att behandla kliniskt, och forskningsinsatser kunde dra nytta av en tillförlitlig, ambulatorisk små djurmodell av en segmentell femorala defekt. I denna studie presenterar vi en optimerad kirurgiska protokoll för enhetliga och reproducerbara skapandet av en 5 mm kritiska diafysära defekt i en råtta lårbenet stabiliserad med en extern fixeringsanordning. De diafysära ostectomy utfördes med hjälp av en anpassad Jigg för att placera 4 Kirschner trådar bicortically, som var stabiliserad med en anpassad extern fixeringsanordning enhet. En oscillerande ben såg användes för att skapa defekten. Antingen en kollagen svamp ensam eller kollagen svamp indränkt i rhBMP-2 var implanteras i defekten och den benläkning övervakades under 12 veckor med hjälp av röntgenbilder. Efter 12 veckor, råttor offrades och histologisk analys utfördes på kontrollen exciderad och behandlade lårbenet. Ben defekter som innehåller endast kollagen svamp resulterat i icke-unionen, medan rhBMP-2 behandling gav bildandet av en periosteal känslokallt och nya benremodellering. Djur återvunna väl efter implantation, och extern fixering visat sig framgångsrikt för att stabilisera de femorala defekterna under 12 veckor. Denna strömlinjeformade kirurgiska modell kan lätt tillämpas för att studera benläkning och testa nya ortopediska biomaterial och regenerativ terapier i vivo.
Introduction
Ortopediska Traumakirurgi fokuserar på behandling av ett brett utbud av komplexa frakturer. Kritiska diafysära segmentell ben defekter har visat sig svårt att behandla kliniskt på grund av den omgivande muskler och periostet minskad regenerativ förmåga samt bristande lokaliserade angiogenes1. Moderna behandlingstekniker omfattar operativ fixering med bentransplantat, fördröjd bengraft (Masquelet), ben transport, fusion eller amputation2,3,4. Hos de flesta patienter som har ambulatorisk funktion bevaras efter deras trauma, med väl fungerande distala lemmar, är lem bärgning helt klart en bättre behandling alternativ5. Dessa bärgning behandlingar kräver ofta iscensatta kirurgiska ingrepp över en lång behandlingsperiod. Vissa författare har föreslagit att extern fixering är överlägsen jämfört med den intern fixering för dessa program på grund av minskad vävnadsskadan under implantation, minskat implanteras yta, och ökad postoperativ justerbarhet av fixeringsanordning6. Dock pågår en prospektiv randomiserad kontrollerad studie för att klargöra denna kontrovers interna kontra extern fixering i svåra öppna frakturer av tibia7. Tyvärr kvarstår betydande komplikation och fel priser med antingen behandling som valts,8,9. Kirurgen måste antingen behandlingsmetod, med avseende på den segmentell benförlust, brottas med segmentell diafysära defekter som presenterar betydande utmaningar. Korrigeringar av segmentella defekter måste maximera ben stabilisering och samtidigt förbättra osteogent processen10,11.
På grund av klinisk betydelse, men den lägsta volymen, av kritiska och medelstora diafysära segmentella defekter, är en effektiv, reproducerbara djurmodell nödvändig för att forskargrupper att avancera behandlingstekniker och i slutändan förbättra kliniska resultat. Forskare behöver studera i vivo fysiologiska läkande mekanismer i ett däggdjur djurmodell. Medan sådana modeller av extern fixering redan existerar12,13,14,15, hoppas vi kunna ge en mer tillförlitlig metod för utebliven frakturläkning i obehandlade djur, minska kostnaderna genom valet av prisvärd fixeringsanordning material och disposition ett okomplicerat kirurgiska protokoll för den lätta för att framtida studier. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att upprätta en tillförlitliga och reproducerbara modell av en kritisk diafysära defekt hos råttor. Förfarandet utvärderades genom att bedöma stabilisering och ben helande i råtta lårbenet under 12 veckor. De sekundära målen ingår: att göra en prisvärd modell som ett kostnadseffektivt som möjligt, vilket förenklar kirurgisk metod och stabilisering och säkerställa etiska hand om djuren. Författarna och forskargrupp genomförde preliminära experiment med en rad olika biomaterial och potentiella regenerativa behandlingar för att förbättra läkningen i denna segmentell defekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De råttor som används i denna studie fick daglig vård enligt AVMA riktlinjer för avlivning av djur: 2013 Edition16. Den institutionella djur vård och användning kommittén vid University of Wisconsin-Madison utvärderas och godkänt detta experimentellt protokoll innan projektet startade.
1. djur
- Använd de outbred manliga Sprague-Dawley-råttor som väger ca 350 g.
2. upprättande av Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) indränkt svamp ställningar
Obs: Byggnadsställning beredning bör inträffa strax före implantation i lårbenet (se steg 6.14).
- Följ tillverkarens anvisningar för användning av en etablerad rhBMP-2 ben graft kit som innehåller en kollagen svamp, frystorkade rhBMP-2 och sterilt vatten för beredning17. Att upprätthålla sterilitet, beredes rhBMP-2 med sterilt vatten till en koncentration av 1,5 mg/mL.
- Med steril sax och en steril linjal, trimma rhBMP-2 blöt kollagen svampen att omforma för att passa en 5 x 3 mm 3 mm defekt.
- Med en spruta, fördela rhBMP-2 lösningen jämnt över kollagen svampen så att den absorberas.
3. beredning av anpassade extern fixering enhet
Obs: Se figur 1A för en mer komplett lista över dimensioner.
- Minska aluminium ark lager (typ 6061, 0,088 ”tjocklek) till två stycken (1.4” x 6 ”) med hjälp av en sticksåg eller annat lämpligt verktyg.
- Montera ett stycke i fräsmaskin och, med hjälp av en 1/8 ”90°-punkt hårdmetall borr kvarn, skär fyra 'V' grooves (0,035-tums djup) på längden. Lämna andra lappa gratis av nedskärningar.
- Klippa ut enskilda plattor av 0,3 ”bredd från två bitar (figur 1B). Mäta och borra skruvhål för 4-40 tråd. Tryck på plattan med 'V' spår med 4-40 tråden. Borra på plattan utan spår för en #4 skruv kropp borr.
- Sand båda bitar att runda hörn och minska vikten (figur 1 c).
- Skruva bitar tillsammans med 4-40, 18-8 rostfritt stål cap kullrigt huvud (0,25 ”) så att spåren är spola mot vanligt plattan (figur 1 d)
4. narkos förfarande och analgesi
- Inducera anestesi genom att placera råtta i induktion kammare att leverera 4 L O2/min med 4% isofluran.
FÖRSIKTIGHET: Forskningspersonal måste undvika inandning av bedövningsmedel gas och upprätthålla korrekt huva och ventilation i laboratoriet. - Ta bort råttan från kammaren efter råttan förlorar rätande reflex, bifoga en Kona och placera på Underhållsdosen av anestesi genom näsan (O2 leveransgrad till 2-3 L/min och 0,8% isofluran).
- Placera råtta på en värmedyna eller under värmande ljuset att förhindra hypotermi.
- Bekräfta tillräcklig djup anestesi genom klämmande tån eller testa den palpebrala reflexen.
- Tillämpa smörjning till ögon att förhindra uttorkning av hornhinnan.
- Leverera en subkutan injektion med förlängd frisättning buprenorfin (1 mg/kg) på stammen/dorsum av råtta, långt från operationsområdet, att ge smärtlindring i upp till 3 dagar efter operation.
5. aseptisk beredning och antibiotika Kronärtskocksextrakt
- Raka området runt hindleg med den 13: e revbenet, foten, dorsala mittlinjen och ventrala mittlinjen som marginaler.
- Scrub rakade området med hjälp av steril 2 x 2 gasbinda indränkt med 10% povidonjod följt av 70% EtOH (4 gånger varje, alternerande).
- Administrera en intramuskulär injektion av cefazolin (20 mg/kg) i operativa quadriceps.
- Administrera enrofloxacin (0,25 mg/ml) i dricksvatten för 7 dagar postoperativt för fortsatt antibiotika skydd.
- Placera råttor på foder (t.ex. Uniprim) under hela studien att förhindra pin-områdesinfektioner.
- Gäller Dubbelrum antibiotisk salva till hud-pin gränssnitt en gång dagligen i 3 dagar postoperativt.
Obs: Undvik någon extern fixering pin eller klämma lossnar vilket kan bidra till utvecklingen av en infektion.
6. kirurgiska ingrepp
Obs: Göra en samordnad insats för att upprätthålla ett sterilt fält och arbetsyta och följ steril teknik i hela helheten av fallet.
- Förlänga rakade benet genom fenestrated, tydlig klibbiga drapera och täcker kirurgiska bänk i sterila handdukar för att skapa ett sterilt fält.
- Palpera lårbenet och använda ett #15 blad för att skapa ett anterolateralt snitt genom huden sträcker sig från knäskålen till den större trochanter på proximala lårbenet.
- Noggrant incisionsfilm laterala ben fascian längs intermuscular septum att separera vastus lateralis muskeln quadriceps anteriorly från hamstrings posteriort tills laterala femur är utsatt. Bevara kidnappare gluteala senan insättningspunkten på ju större trochanter.
- Utföra en försiktig, atraumatiska omkretsriktningen mjuk vävnad dissektion och exponera lårbenet på dess mitten av diaphysis börjar på den laterala ytan. För att göra detta, Använd en #15 blad att försiktigt skära muskeln från det underliggande benet genom att hålla kniven parallellt mot konturen av benytan. Använd en periosteal Hiss lyft muskeln från den exponerade ben som det är dissekeras och fortsätta runt femorala skaftet tills 7-10 mm av centrala diaphysis har rensats av mjuk vävnad på alla sidor för att förbereda för ostectomy.
Obs: Undvik skada på den mediala femorala neurovaskulära bunten. - Infoga fyra 1,0 mm Kirschner (k)-ledare: 2 proximala och distala i lårbenet vinkelrätt mot laterala femur, 2 regisserad raka lateral till medial. Säkerställa alla stift engagera båda cortices (bicortical) för tillfredsställande stabilitet (figur 2A).
- Börja med den distala-mest pin, precis i nivå med den laterala epikondylen. Plats jiggen spola till laterala distala lårbenet och infoga en 1.0 gängade spets k-tråd.
- Att bibehålla positionen för jiggen på ben, identifiera där den mest proximala pin kommer in benet baserat på jiggen hålen. När positionen bestäms, noggrant incisionsfilm parallellt med fibrerna i gluteala senan som behövs för att skapa en liten lucka i vävnaden för proximala stift att passera, sålunda minimizing iatrogen skada på senan. Borra en 1,0 mm icke-trådad k-tråd i denna klyfta, igen säkerställa pin engagerar båda cortices (figur 2B).
- Behålla jiggens position i kontakt med benet och borra två 1,0 mm gängade k-trådar, en på vardera sidan av framtida defekten. Säkerställa pins engagera båda cortices (figur 2 c).
- Placera den extern fixeringsanordning bar nivå 1 cm ovanför huden och skruva ordentligt, låsning i baren på plats. Klipp överflödigt pin längderna (figur 2D).
- Förbereda för ostectomy (defekt skapande) genom att placera en liten, böjd upprullningsdon runt främre och bakre lårbenet att skydda omgivande mjukvävnad, muskel och neurovaskulära bunt. Utnyttja en ~ 5 mm sagittal oscillerande sågblad, mycket försiktigt skapa en 5 mm segmentell defekt genom den mitten av diaphysis. Applicera en ljus, jämnt tryck med såg att undvika onödiga fraktur (figur 2E).
- Gäller små mängder bevattning (rumstemperatur 0.9% steril fysiologisk koksaltlösning (NS)) som behövs när du skapar defekt för att undvika termiska nekros i ben.
- Spola såret med 10 mL NS efter att skapa defekten.
- Administrera 0,1 mL av en 0,25% bupivakain med adrenalin (1: 200, 000) på såret som smärtstillande och vasokonstriktor.
- Infoga scaffolden (5 x 3 x 3 mm) av kollagen svamp eller rhBMP-2 indränkt svamp (från steg 2) in i defekten. Varje byggnadsställning bör dimensioneras på rätt sätt för att span längd och volym av felet, hjälper svampen bo i position.
Obs: vid denna punkt, mRNA komplex kan vara beredd och injiceras som beskrivs i steg 7.1-7.3 nedan om utför mareld imaging. - Stäng muskel planet använda enkla avbruten mönster med 4-0 resorberbar sutur. Stäng hudlagret med hjälp av arbetsprofilen resorberbar körs med 4-0 resorberbar sutur och hud lim att stänga luckor runt utskjutande stift.
- Ta bort råttan från näsan konen, kvar på värmedyna, och övervaka kontinuerligt tills råttan kan konsekvent upprätthålla en upprätt hållning. Vid denna punkt, placera i en ren bur att återvinna.
7. förberedelse av komplex mRNA och mareld imaging
Obs: Transfection med mRNA komplex bör utföras under operation 1 dag före luminiscens imaging. Använd steril teknik vid hantering mRNA.
- Blanda 10 µL av mRNA kodning för Gaussia luciferas (lager koncentration av 1 µg/µL) med 30 µL av lipidic transfecting agent.
- Tillåta för de mRNA-lipid komplex form genom inkubation för minst 5 minuter i rumstemperatur. Lipidic transfecting agenten kommer att kondensera de mRNA-molekylarna, stabilisera dem och effektivisera transfection.
Obs: Om komplexen inte används omedelbart, lagra dem i isen maximalt 1 h. - Med 20 µL pipett utrustad med filtrerade tips injicera hälften av volymen av mRNA komplex till distala och proximala ändarna av defekt, respektive.
- Följande dag, 3 min innan imaging, söva råtta med inhalerade isofluran som tidigare beskrivits i steg 4.1.
- Placera råtta i en in-vivo imaging kammare utrustade med en Kona levererar underhåll isofluran (0,8% isofluran, O2 leverans hastighet av 2-3 L/min).
- Injicera coelenterazine resuspended i saltlösning i en dos på 4 mg/kg kroppsvikt i närheten av defekten.
- Förvärva mareld bilder med den i vivo imaging system (IVIS) enligt tillverkarens instruktioner18.
8. imaging protokoll
- Efter kalibreringen vanligt radiografisk maskinen, en röntgen system19, söva råtta med inhalerade isofluran som tidigare beskrivits (se steg 4.1) och placera råtta i en Kona med inhalerade isofluran (0,8% isofluran, O2 leverans hastighet av 2-3 L/min) för en anteroposterior (AP) lårbenet röntgenbild.
- När råttan är sternala koordinationsrubbning, avancera det kirurgiska bakbenet framåt, böjning i höften och kväva joint. Flex kväva leden till ca 90°. Tejpa den tass plantar sidan ner, nära kroppen väggen. Placera skenbenet framåt från lårbenet att eliminera möjligheten att överlagras ben. För att ge liten bortförandet av höften, placera en genomskinlig svamp (ca 15 mm tjock) i regionen ljumske. Sedan få en anterior-posterior (kranial-kaudala) bild av lårbenet.
- Upprepa detta AP lårbenet radiografisk Visa omedelbart efter kirurgi, 4 veckor och 12 veckor. Använd tejp och gasväv att korrekt placera djurets extremitet för kvalitet och konsekvent imaging.
- Ta bort råttan från näsan konen och övervaka kontinuerligt tills råttan kan konsekvent upprätthålla en upprätt hållning. Sedan placera tillbaka i buren.
9. histologiska förfarande
- Avliva råttor i en kammare med inhalerade CO2 enligt AVMA etiska normer16.
- Följande eutanasi, raka bakbenet, ta bort huden från operativa extremiteten och talseuropéer lårben på höften. Ta försiktigt bort alla mjuk vävnad från operativa lårbenet (inklusive alla muskler, senor och ligament). Lämna endast ett tunt lager av muskler som omger den defekta platsen för att skydda regionen helande från oavsiktlig skada under dissektion.
- Placera lårbenet i 10% Neutral buffrad Formalin i rumstemperatur i 3-4 dagar för fixering. Hålla en 15:1 formalin vävnad volym-förhållande. Ändra lösningen när halvvägs genom fixering processen.
- Om avkalkning lårbenet i en 15% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pH 6,5 syralösning för 3-4 veckor. Samla in följetong röntgenbilder för att avgöra urkalkning endpoint.
- Tudela lårbenet longitudinellt med ett snitt från främre till bakre i mitten av-sagittala planet. Skicka in vävnad för standard paraffin inbäddning och hematoxylin och eosin (H & E) färgning.
- Skicka H & E glider en patolog för histologisk bedömning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Operationer utfördes i cirka en timme av en kirurg med hjälp av en assistent. Efter kirurgisk optimering, intra- och postoperativa komplikationer var mycket minimeras och användning av jiggen apparaten säkerställas konsekvent storlek (5 x 3 x 3 mm) och lokalisering av femorala defekter. Råtta var ambulatorisk omedelbart följande återhämtning från anestesi och tycktes inte ha någon förändrade beteendemönster; deras rörelser var inte antalgiska, och de verkar inte störas av den extern fixeringsanordning.
Icke-gängade k-trådar valdes för den mest proximala stiftet (figur 2B), som den proximala pin hade störst risk för att bryta när gängade ledningar användes. I vissa fall, särskilt i kontroll styra djur utan rhBMP-2 eller byggnadsställningar vars defekter visade inga tecken på läkning/benbildning, en eller flera k-tråd tips bröt efter ca 8 veckor som sett i svampen bara röntgenbild av exciderad lårbenet ( Figur 3).
Röntgenbilder och histologi (H & E fläcken) analyserades för att bedöma nivåer av benläkning. Negativ kontroll defekter som innehåller endast en kollagen svamp visade inga tecken på överbrygga osteogenesis mellan de proximala och distala benkanter (figur 3, figur 4). En liten mängd nya benremodellering kan ses i direkt anslutning till skära lårbenet kanten; felet själv visar en brist på beniga material, förekomsten av brosk och vissa kvarstående hematom (figur 4). Defekter som innehåller rhBMP-2 indränkt svamp visat betydande ben healing så tidigt som 4 veckor efter operationen, vilket framgår av den röntgentäta känslokallt överbrygga över defekten i figur 3. Efter 12 veckor, signifikant nya mineral nedfall (figur 4, NB: nytt ben, PC: periost känslokallt) har bildats i hela felet. Betydande nya periost ben kan ses i den känslokalla sträcker sig från kanten skär lårbenet och benbalkar av vävda och lamellär ben har utvecklat hela felet. Brosk nedfall är inte sett (figur 4).
Histologi (H & E fläcken) utfördes också för både en virusfri kontroll och ett exempel på en infekterad lårbenet (figur 5). Infekterade lårbenet är kraftigt förstorad, visar tecken på en endosteala reaktion infiltrera ben cortex. Pilar indikerar områden av osteoclast-medlad benresorption för patologisk. Oinfekterade lårbenet cortex förblir kompakt och med en tydligt avgränsad lamellär cortex. Antibiotika dosering var optimerad för att inkludera maximal täckning postoperativt. Medan infektion runt defekten kan förekomma, fortsatt administrering av antibiotika lokalt runt pin platser och i vatten och kost visade sig vara framgångsrik i att minimera postoperativ infektion.
Ytterligare imaging använder In Vivo Imaging System (IVIS) illustrerar möjligheten för självlysande celler att visualiseras inom felet efter implantation av en extern fixeringsanordning (figur 6). Yttre plattan kan tas enkelt bort för avbildning och ersättas efter avslutad. Celler i märghålan luminesce efter transfection med komplex mRNA kodning för Gaussia luciferas. Den högsta nivån av luminiscens är inriktad på platsen för den femorala defekten och signalen blockeras inte av fixering enhet stiften. Detta är lovande för framtida studier förlitar sig på mareld eller fluorescens att mäta biologiska förändringar såsom en gen eller protein uttryck under läkningsprocessen.
Figur 1: Extern fixeringsanordning fabrication. A: CAD Schematisk bild av den sammansatta extern fixeringsanordning med kommenterad dimensioner för korrekt tillverkning. Varje fixeringsanordning är sammansatt av två aluminiumplattor som hålls samman av två skruvar. B: plattorna skärs från 1.4 ”x 6” aluminium ark med 'V' spår skuren i bladet längst ner. C: skruvhål borras plattorna (gängad i plattan med 'V' grooves) och alla kanter och hörn är slipad för att runda och minska vikten. D: monterade extern fixeringsanordning dras åt med skruvarna (4-40 x 0,25 ”, 18-8 rostfritt stål knappen huvud GJP) när stiften är på plats i 'V' spår på insida av aluminium pläterar. Vänstra stiftet är icke-gängade och är mest proximala på lårbenet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk av pin placering, fixeringsanordning placering och defekt skapandet. A: den distala pin (1,0 mm gängade k-tråd) är placerad i regionen epikondylen metafyseala med jiggen (blå rektangel) för att vägleda korrekt pin införande. Jiggen är placerad på anterolaterala femorala yta. B: proximala pin (1,0 mm icke-trådad k-tråd) placeras med jiggen efter att göra ett litet snitt i gluteala senan. C: mittersta stiften (1,0 mm gängade k-tråd) infogas med jiggen. D: jiggen avlägsnas och 2 plåtarna är kopplade till stiften använder de 2 skruvarna för att säkra plattorna. Plattorna är åtdragna 1 cm ovanför huden nivå att undvika tryck på huden. E: en sagittal oscillerande såg används för att skapa en 5 mm defekt mellan två mittersta stiften. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa högupplösta röntgenbilder visar Ben healing med rhBMP-2 behandling. Bilder för den negativa kontroll kollagen svampen och rhBMP-2 indränkt svamp grupper visas på 0, 4 och 12 veckor postoperativt. Behandlingsgruppen rhBMP-2 uppvisar betydande läkning efter 4 veckor med känslokallt spanning defekten. Negativ kontroll lårbenet ändarna läker inte med överbrygga ben och felet kvarstår en utanför unionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Betydande ny benbildning som ses med rhBMP-2 behandling. Representant 4 x förstorade H & E histologiska bilder för den negativa kontroll kollagen svampen och rhBMP-2 indränkt svamp grupper både på skurna lårbenet kanten och i defekten. Nytt Ben bildas runt den kontroll lårbenet kanten, men betydande tillägg av nya trabekulärt ben såväl som periost känslokallt projektet från behandlade lårbenet. Inget beniga material ses inom kontroll defekt, medan betydande benbildning kan observeras i hela rhBMP-2 behandlade defekten. NB: nytt ben, F: lårbenet, C: brosk, H: blödning, PC: periost känslokallt. Skalstapeln: 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Infekterade lårben uppvisar hypertrofi och inflammatoriska celler markörer. H & E histologiska bilder av en icke-infekterade lårbenet jämfört med en infekterad lårbenet, i fullständig vy och på 4 x förstoring av boxed platser. Oinfekterade femorala cortex förblir organiserade och avgränsade, med få tecken på inflammation. Infekterade lårbenet förstoras kraftigt, vilket kan ses i helbild och cortex bryts upp av områden med benresorption och nekros (lila cell kluster indikeras av svarta pilar). F: lårbenet. Skalstapeln: 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: Gaussia luciferas signal upptäckt i defekten. Luminiscens celler transfekterade med Gaussia luciferas mRNA är avbildade med IVIS efter yttre plattan borttagning. Rött anger högsta luminiscens intensiteten på platsen för den femorala defekten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Små modeller av ortopediska skador såsom komplett benfrakturer möjliggöra forskning som utforskar mekanismer osteogenesis och bedömningen av den terapeutiska potentialen av biomaterial20. Denna studie introducerar en råtta segmentell defekt modell stabiliseras av en anpassad extern fixeringsanordning som ett lab och biomedical engineering team kan lätt reproducera för ytterligare studier av bärande osteosynthetic ben reparation.
Tidigare studier med kritiska-stora defekter i råtta modeller ofta är beroende av intern fixation tallrikar21,22,23,24. Även om antingen fixering metoden är kliniskt godtagbar, har extern fixering distinkta fördelar orsakar mindre störningar i mjuk vävnad och blodförlust, minskar den totala implanterade yta för att minimera möjligheter för bakteriell Kolonisation, och möjliggör postoperativ justerbarhet och stegvis kirurgiska ingrepp6. Tidigare extern fixering djur fraktur modeller har använt olika plattmaterial, pin lastsäkrings eller ben skära metoder12,13,14. Eftersom den externa fixeringsanordning i detta protokoll gjordes i Labbets workshop med låg kostnad aluminium och kan vara enkelt renoverade, var kostnader minimeras. Detta ger en ekonomisk extern fixeringsanordning tillåter forskare att utföra experiment med flera djurgrupper utan att vara begränsade ekonomiskt. Jämfört med en intern fixation modell anser vi att detta system är tekniskt enklare och fler reproducerbara i en liten djurmodell. Vår erfarenhet med dessa modeller, intern fixation är betydligt mer krävande tekniskt och kan kräva anpassade-frästa implantat. Till författarnas kunskap, detta övergripande protokoll är unik i sin användning av en specialdesignad jigg kombinerat med en anpassad metall extern fixeringsanordning design15, liksom dess användning av en oscillerande ben såg att bättre representera gemensamma kliniska scenario periost strippar utförs för att förbereda fraktur platser för fixering. En sista anmärkning om användningen av en oscillerande såg i denna modell är att den värme som alstras och periost störningar som uppstår ger en sista del av kontroll i bilda en icke-unionens modell. Vår erfarenhet har varit att med andra metoder, i dessa djurmodeller, utredare riskerar att kontrollerna healing.
För att säkerställa kirurgiska framgång, försiktighet bör iakttas vid flera kritiska steg: när öppning och utför omkretsriktningen dissektion för att exponera lårbenet från omgivande muskler, undvika störande den ischias nerv caudally, femorala fartyg medialt, och gluteala senan proximalt. Var noga med att placera jig apparater parallellen och spola mot plana, anterolateralt ansikte av lårbenet så att alla stift är exakt vinkelrätt mot benet. Detta bekräftar korrekt uppriktning av den extern fixeringsanordning och minska sannolikheten för PIN-brott. Ordningen på pin placering fann vara enklaste var distala först, följt av proximala och sedan båda mitten stift. Detta tillåts för mindre störningar av gluteala senan av proximala pin. Slutligen är det viktigt att varje pin är placerad bicortically, penetrerande båda cortices så att den inte backa ut ur benet eller skifta in i märghålan.
En röntgenapparat som är kapabel av högupplösta radiografi användes för att övervaka benläkning status som kvalitativa förändringar kan visualiseras enkelt och icke-invasivt över tid. Konsekvent ben positionering är dock avgörande för korrekt röntgenologiska tolkningen som skillnader i positionering kan vara vilseledande. Resultaten från denna studie är överens med tidigare arbete visar att en 5 mm femorala defekt förhindrar spontan läkning i normala råttor25. Därför, någon healing som är noterade med extra terapier såsom den rhBMP-2 indränkt svamp slutgiltigt kan hänföras till respektive behandling (figur 3).
Möjliga oro för denna teknik inkluderar pin brott, lossa och infektion. Problem med proximala pin brott i Preliminär testning föranledde en switch från gängade till icke-trådad k-tråd. Icke-gängade stift är mekaniskt starkare men också innebära mer risk att backa av cortex. Särskilt i tomma ben defekter, k-trådar kan bryta eller vara fördrivna omkring 8 veckor på grund av långvarig cykliska pin lastning och bristande läkning (på samma sätt som cykling/böja ett gem). En strikt antibiotikum regim utnyttjades för att inkludera en omedelbar cefazolin injektion, daglig applicering av antibiotikumet salva på snitt platsen, 7 dagar av enrofloxacin läggs till dricksvatten, och en medicinfoder. Detta antibiotikum protokoll, tillsammans med de lämplig kirurgisk teknik som beskrivs ovan, minimerat infektion (figur 5).
En av de ytterligare fördelarna med extern fixering i en djurmodell är enkel borttagning för fri utsikt av defekten och bytas ut efter imaging. Detta möjliggör effektivare i vivo avbildningstekniker som förlitar sig på fluorescens eller luminiscens att bedöma förändringar såsom uttrycket gen eller protein. Vi har exempelvis visat att celler i märghålan transfekterade med komplex mRNA kodning för Gaussia luciferas kan visualiseras med IVIS. Figur 6 visar att luminiscens signal identifieringsmöjligheter inte hindras av detta yttre fixering tillvägagångssätt som kan det med interna plattor, skruvar, eller intramedullära spikar21,22,23 , 24. detta kostnadseffektiva och reproducerbara kirurgiska protokoll möjliggör konsekvent skapande och stabilisering av en kritisk storlek femorala defekt som härmar den inledande klinisk hanteringen av dessa komplexa frakturer. Inrättandet av en tillförlitlig djurmodell är avgörande för alla experimentella behandlingar avsedda för eventuell klinisk användning. Vår modell har visat förutsägbara resultat och minimal beteendeförändringar eller obehag i våra djur. Denna modell kan användas med en mängd biomaterial-baserade ställningar i samband med bildgivande tekniker utnyttjas i detta papper för framtida translationell teständamål. Det är vår förhoppning att arbeta med denna modell, forskare kommer att kunna utforma nya sätt att behandla kritiska bendefekter trauma patienter. Detta skulle kunna undvika sjukligheten och kosta i långa behandlingar för närvarande anställd och eventuellt minska antalet amputationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiska intressen eller förmåner. Det har inga förmåner som erhållits direkt eller indirekt av författarna till denna artikel.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en NIH utrustning Grant 1S10OD023676-01 med ytterligare stöd som tillhandahålls genom University of Wisconsins avdelningar av ortopedi och rehabilitering och School of Medicine och folkhälsa. Vi vill uppmärksamma UW Carbone Cancer Center stöder Grant P30 CA014520 och användning av deras små djur Imaging anläggning, samt NIH utbildning Grant 5T35OD011078-08 för stöd av H. Martin. Vi tackar också Michael och Mary Sue Shannon för deras stöd för muskuloskeletala regenerering partnerskapet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
