Оценка и характеристика гиалоидных сосудов у мышей
Summary
Этот протокол описывает как in vivo, так и ex vivo методы полной визуализации и характеристики гиалоидных сосудов, модель сосудистой регрессии в глазах мышей, используя оптическую комппореную томографию и флоуресцейну для живой визуализации и ex vivo изоляции и последующего плоского крепления гиалоида для количественного анализа.
Abstract
В глазу эмбриональные гиалоидные сосуды питают развивающуюся линзу и сетчатку и регресс, когда сосуды сетчатки развиваются. Стойкие или неудачные регрессии гиалоидных сосудов можно увидеть при таких заболеваниях, как стойкий гиперпластический первичный стекловид (PHPV), что приводит к затруднению светового пути и нарушению функции зрения. Понимание механизмов, лежащих в основе регрессии гиалоидных сосудов, может привести к новым молекулярным знаниям в процессе регрессии сосудов и потенциальным новым способам управления заболеваниями с помощью стойких гиалоидных сосудов. Здесь мы описываем процедуры визуализации гиалоида у живых мышей с оптической когеренционной томографией (OCT) и фундусийской ангиографией (FFA) и подробный технический протокол изоляции и плоскомонтажа гиалоид ex vivo для количественного анализа. Низкой плотности липопротеинов рецепторов, связанных с протеином 5 (LRP5) нокаут мышей были использованы в качестве экспериментальной модели стойких гиалоидных сосудов, чтобы проиллюстрировать методы. Вместе эти методы могут способствовать тщательной оценке гиалоидных сосудов в качестве экспериментальной модели сосудистой регрессии и исследований механизма стойких гиалоидных сосудов.
Introduction
Кровоснабжение глаз имеет важное значение для обеспечения нормального развития сетчатки и окружающих глазных тканей и оснащения надлежащей зрительной функции. В глазу три сосудистые кровати: сосуды сетчатого глаза, сосуды и переходные эмбриональные кровообращения. Развитие глазной сосуды требует пространственной и временной координации на протяжении всего эмбриогенеза и созревания тканей. Среди трех сосудистых кроватей, гиалоидная сосудоза является первой функциональной системой кровоснабжения для обеспечения питания и кислорода для вновь сформированной эмбриональной линзы и развивающейся сетчатки. Гиалоидные сосуды регрессируют в то жевремя, что сосуды сетчатки развиваются и созревают 1. Регрессия гиалоидной сосуды имеет решающее значение для обеспечения четкого визуального пути для развития зрительной функции; следовательно, этот процесс сосудистой регрессии так же важен, как и рост сосудов в области сосуды. Нарушение гиалоидной регрессии может привести к заболеваниям глаз. Кроме того, регрессия гиалоидных сосудов обеспечивает модельсистемы для исследования клеточных и молекулярных механизмов, участвующих в регрессии сосудов, что может иметь последствия для ангиогенной регуляции и в других органах.
Гиалоидная сосуда, полученная из гиалоидной артерии (HA), состоит из ваза гиалоидеи проприии (VHP), туника васкулоза лентиса (TVL) и мембраны зрачков (PM). Он обеспечивает питание развивающейся сетчатки, первичного стекловидного тела, и хрусталика во время эмбрионального развития2. В результате HA, VHP ветви передняя через стекловидное тело к объективу. TVL чашки задней поверхности капсулы объектива, и анастомоза хм, который соединяется с передней цилиарных артерий, охватывающих переднюю поверхность объектива2,3, в результате формирования сети судов в PM 3 , 4 , 5. Интересно, что в сваске гиалоида нет вен, и система использует сосуды для выполнения венозного дренажа.
В человеческом эмбрионе, гиалоид сосуды почти завершена примерно на девятой неделе беременности и начинает регрессировать, когда первые сосуды женевки появляются, в течение четвертого месяца беременности2. Начиная с атрофии VHP, регрессии капиллярных сетей TVL, PM, и, наконец, HA происходит впоследствии2,3. Между тем, первичные стекловидного втягивания и вторичного стекловидного начинает формироваться, состоящий из внеклеточных компонентов матрицы, в том числе коллагеновых волокон. К шестому месяцу беременности первичный стекловид превращаета сводится к небольшому прозрачному каналу, простираясь от диска зрительного нерва до объектива, называемого каналом Cloquet или гиалоидным каналом, а вторичный стекловидный становится основным компонентом заднего сегмента 2 , 3. Циркуляция гиалоида исчезает в основном на 35 до 36 недель беременности, незадолго до рождения3.
В отличие от людей, у которых гиалоидная сосудистая полностью регрессирует при рождении, мышь гиалоидная сосудистая система начинает регрессировать после рождения. Как мышь сетчатки рождается сосудистой и сетчатки сосудов развиваться послеродовой, гиалоидные сосуды регресс одновременно с послеродового дня (P) 4 и в основном полностью регрессируется P216 (Рисунок 1). PM исчезает сначала между P10 и P12, и VHP исчезает между P12 и P16, в то время как небольшое количество ТВЗ и HA клеток остаются даже на P16, и P21 регрессии гиалоидной сосудистой системы почти завершена6. В то же время, сосуды для стыковки с ы ветвей на гриле начинают развиваться после рождения. Поверхностный слой сосудистого сплетения полностью распространяется на периферийную сетчатку при P7-P8, глубокий слой (расположенный во внешнем плексиформном слое) развивается из P7-P12, и, наконец, промежуточное сплетение во внутреннем плексиформном слое развивается между P12 и P157 . По мере развития сосудов сосудов сосудов сосудов соты, она постепенно заменяет функцию сопутствующего регрессирования гиалоидных сосудов, обеспечивая питание и кислород развивающемуся глазу. Послеродовое возникновение регрессии гиалоидных сосудов у мышей обеспечивает легко доступную экспериментальную модель для наблюдения и изучения гиалоидной сосуды, а также молекулярную основу, регулирующую процессы сосудистой регрессии в рамках как физиологических, так и физиологических и патологические состояния8.
Отказ гиалоидной регрессии можно увидеть при таких заболеваниях, как PHPV, который является редкой врожденной аномалией развития глаза в результате неудачной илинеполной регрессии эмбриональной, первичной стекловидной и гиалоидной сосуды 9. Механизмы, регулирующие регрессионный процесс гиалоидных сосуд, являются сложными и широко изучены. Один из основных молекулярный путь, необходимый для нормальной регрессии гиалоидных сосудов является Wnt сигнализации пути10, как генетические мутации в этом пути, затрагивающих как Wnt лиганда и рецепторы были связаны с PHPV у людей9. Экспериментальные исследования определили Wnt лиганд, Wnt7b, который производится макрофагами вокруг гиалоидных сосудов в развивающемся глазу, чтобы опосреднить этот процесс регрессии. Wnt7b активирует Wnt сигнализации путем связывания с рецепторами frizzled4 (F’D4)/LRP5 в соседних эндотелиальных клеток, чтобы инициировать апоптоз клетки, что приводит к регрессии гиалоидных сосудов10. В результате, Wnt7b-дефицитных мышей показать стойкость гиалоидных сосудов10. Аналогичным образом, нетрадиционный лиганд Wnt, Норрин (кодируется геном Ndp), также связывается с F’D4/LRP5, чтобы вызвать регрессию гиалоидных сосудов во время разработки. Ndpy/- , Lrp5-/-, и Fzd4-/- мышей все отображения отложено гиалоидной регрессии судна, поддерживая важную регулятивную роль Wnt сигнализации11,12, 13,14,15,16. Кроме того, другой Wnt coreceptor LRP6 перекрывает сярприг с LRP5 в своей функции по модуляции сигнального пути Wnt в гиалоидных сосудистых эндотелиальных клетках17. Другие факторы, которые также могут способствовать гиалоидной регрессии включают гипоксия-индуцируемый фактор18,19, сосудистый эндотелиальный фактор роста20,21, коллаген-1822, 23, Arf24, ангиопоэтин-225, и костной морфогенетический белок-426. В этой работе мы используем Lrp5-/- мышей в качестве модели стойких гиалоидных сосудов, чтобы продемонстрировать методы оценки и характеристики гиалоидных сосудов с помощью методов in vivo и ex vivo.
Визуализация гиалоидных сосудов in vivo и ex vivo необходима для изучения механизмов регрессии гиалоидных сосудов. Современные методы наблюдения гиалоидных сосудок в основном сосредоточены на визуализации и анализе VHP и HA, с помощью изображений OCT и FFA, секций поперечных сечений глаз и плоского крепления гиалоидов. OCT и FFA являются мощными инструментами визуализации in vivo, позволяющими проводить продольные наблюдения у живых животных после того, как они открыли глаза. Кроме того, изолированное гиалоидное плоское крепление обеспечивает визуализацию всей гиалоидной сосуды и средство для достижения точной количественной оценки числа сосудов. Тем не менее, тонкий и хрупкий характер гиалоидных сосудов и в результате технические трудности его изоляции, возможно, ограничили его использование в исследованиях глаз несколько10,17,27. В этой работе мы предоставляем подробный протокол визуализации гиалоидных сосудов, сочетая как in vivo живую визуализацию жевийной корыстной полости, так и ex vivo изолированные гиалоидные плоские крепления для повышения осуществимости этих методов. Этот протокол был адаптирован с модификацией и расширением от предыдущих публикаций на in vivo метод живой fundus и OCT изображений28 и ex vivo метод изолированных гиалоид плоский монтаж11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы оценки и характеристики гиалоидных сосудов являются интуитивными и необходимыми процедурами для наблюдения регрессии гиалоидных сосудов в моделях животных, чтобы позволить исследования механизмов, лежащих в основе сосудистой регрессии во время развития. В то время как in vivo ви…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты (R01 EY024963 и EY028100) в JC З.В. была поддержана Рыцари тамплиеров Глаз Фонд Карьера Грант. Процедура изоляции гиалоидов, описанная в этом исследовании, была адаптирована с модификацией протоколов, щедро разделяемых докторами Ричардом Лэнгом, Тосихидэ Курихара и Лоис Смит, которым авторы благодарны.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
Riferimenti
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
