Bewertung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen bei Mäusen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt sowohl in vivo- als auch ex vivo-Methoden zur vollständigen Visualisierung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen, einem Modell der vaskulären Regression in Mausaugen, unter Verwendung von optischer Kohärenztomographie und Fundusfluorescein-Angiographie für die Live-Bildgebung und ex vivo Isolation und anschließende flache Montage von Hyaloid für die quantitative Analyse.
Abstract
Im Auge nähren die embryonalen Hyaloidgefäße die sich entwickelnde Linse und Netzhaut und treten zurück, wenn sich die Netzhautgefäße entwickeln. Eine anhaltende oder fehlgeschlagene Regression von Hyaloidgefäßen kann bei Krankheiten wie persistenten hyperplastischen Primärglaskörpern (PHPV) beobachtet werden, was zu einem verstopften Lichtpfad und einer beeinträchtigten Sehfunktion führt. Das Verständnis der Mechanismen, die der Regression des Hyaloidgefäßes zugrunde liegen, kann zu neuen molekularen Erkenntnissen über den vaskulären Regressionsprozess und potenziellen neuen Möglichkeiten zur Behandlung von Krankheiten mit persistenten Hyaloidgefäßen führen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Abbildung von Hyaloid bei lebenden Mäusen mit optischer Kohärenztomographie (OCT) und Fundusfluorescein-Angiographie (FFA) und einem detaillierten technischen Protokoll der Isolierung und Flachmontage von Hyaloid ex vivo für die quantitative Analyse. Low-Density Lipoprotein-Rezeptor-bezogene Protein 5 (LRP5) Knockout-Mäuse wurden als experimentelles Modell von persistenten Hyaloid-Gefäßen verwendet, um die Techniken zu veranschaulichen. Zusammen können diese Techniken eine gründliche Bewertung von Hyaloidgefäßen als experimentelles Modell der vaskulären Regression und Studien über den Mechanismus persistenter Hyaloidgefäße erleichtern.
Introduction
Die Blutversorgung im Auge ist wichtig, um die normale Entwicklung der Netzhaut und des umgebenden Augengewebes zu gewährleisten und eine angemessene Sehfunktion zu gewährleisten. Es gibt drei Gefäßbetten im Auge: die Netzhautvaskulatur, die Aderhaut und ein vorübergehendes embryonales Kreislaufnetz von Hyaloidgefäßen. Die Entwicklung der okulären Vaskulatur erfordert räumliche und zeitliche Koordination während der Embryogenese und Gewebereifung. Unter den drei Gefäßbetten ist die Hyaloid-Vaskulatur das erste funktionelle Blutversorgungssystem, das der neu gebildeten embryonalen Linse und der sich entwickelnden Netzhaut Nahrung und Sauerstoff liefert. Hyaloidgefäße treten gleichzeitig zurück, dass sich die Netzhautvaskulaturen entwickeln und reifen1. Die Regression der hyaloiden Vaskulatur ist entscheidend, um einen klaren visuellen Weg für die Entwicklung der visuellen Funktion zu ermöglichen; Daher ist dieser vaskuläre Regressionsprozess ebenso wichtig wie das Wachstum der Netzhautvaskulatur. Beeinträchtigte Hyaloid-Regression kann zu Augenerkrankungen führen. Darüber hinaus bietet die Regression von Hyaloidgefäßen ein Modellsystem zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die an der Regulation der gefäßregression beteiligt sind, was Auswirkungen auf die angiogene Regulation auch in anderen Organen haben kann.
Die hyaloide Vaskulatur, abgeleitet von der Hyaloidarterie (HA), besteht aus Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa lentis (TVL) und Pupillenmembran (PM). Es versorgt die sich entwickelnde Netzhaut, den primären Glaskörper und die Linse während der embryonalen Entwicklung2. VHP, das aus dem HA entsteht, zweigt sich vordergründ durch den Glaskörper zur Linse. Der TVL bechert die hintere Oberfläche der Linsenkapsel und Anastomosen zum PM, der sich mit den vorderen Ziliararterien verbindet und die vordere Oberfläche der Linse2,3bedeckt, was zur Bildung eines Netzes von Gefäßen in der PM führt. 3 , 4 , 5. Interessanterweise gibt es keine Venen in der Hyaloid-Vaskulatur, und das System nutzt Adernvenen, um venöse Drainage zu erreichen.
Im menschlichen Embryo ist die Hyaloid-Vaskulatur etwa in der neunten Schwangerschaftswoche nahezu vollständig und beginnt sich zu regressieren, wenn die ersten Netzhautgefäße während des vierten Schwangerschaftsmonats2erscheinen. Beginnend mit der Atrophie des VHP, Regression der Kapillarnetze des TVL, der PM, und schließlich tritt die HA später2,3. In der Zwischenzeit beginnt sich der primäre Glaskörper zurückzieht und der sekundäre Glaskörper beginnt sich zu bilden, bestehend aus den extrazellulären Matrixkomponenten, einschließlich Kollagenfasern. Bis zum sechsten Monat der Trächtigkeit wird der primäre Glaskörper auf einen kleinen transparenten Kanal reduziert, der sich von der Sehnervenscheibe bis zur Linse erstreckt, der als Cloquet-Kanal oder Hyaloidkanal bezeichnet wird, und der sekundäre Glaskörper wird zum Hauptbestandteil des hinteren Segments 2 , 3. Die Hyaloidzirkulation verschwindet meist bei 35 bis 36 Wochen Schwangerschaft, kurz vor der Geburt3.
Im Gegensatz zum Menschen, bei dem die Hyaloid-Vaskulatur bei der Geburt vollständig zurückgeht, beginnt das hyaloide Gefäßsystem der Maus nach der Geburt zurückzufallen. Da die Mausnetzhaut avaskulär geboren wird und netzhautgefäße sich postnatal entwickeln, treten Hyaloidgefäße gleichzeitig vom postnatalen Tag (P) 4 zurück und werden meist vollständig durch P216 (Abbildung 1) zurückgeleitet. Die PM verschwindet zuerst zwischen P10 und P12, und die VHP verschwindet zwischen P12 und P16, während eine kleine Anzahl von TVL- und HA-Zellen sogar bei P16 verbleiben und durch P21 die Hyaloid-Gefäßsystemregression fast vollständigist 6. In der Zwischenzeit beginnt sich die Netzhautvaskulatur nach der Geburt zu entwickeln. Die oberflächliche Schicht des Gefäßplexus erstreckt sich vollständig auf die periphere Netzhaut bei P7–P8, die tiefe Schicht (in der äußeren Plexiformschicht) entwickelt sich aus P7–P12, und schließlich entwickelt sich der Zwischenplexus in der inneren Plexiformschicht zwischen P12 und P157 . Während sich die Netzhautvaskulatur entwickelt, ersetzt sie nach und nach die Funktion der gleichzeitig zurückgehenden Hyaloidgefäße und versorgt das sich entwickelnde Auge mit Nahrung und Sauerstoff. Das postnatale Auftreten der hyaloiden Gefäßregression bei Mäusen bietet ein leicht zugängliches experimentelles Modell zur Beobachtung und Untersuchung der Hyaloidvaskulatur sowie der molekularen Grundlage für vaskuläre Regressionsprozesse sowohl unter physiologischen als auch pathologische Bedingungen8.
Das Versagen der Hyaloid-Regression kann bei Krankheiten wie PHPV beobachtet werden, die eine seltene angeborene Entwicklungsanomalie des Auges ist, die aus einer fehlgeschlagenen oder unvollständigen Regression der embryonalen, primären Glaskörper- und Hyaloidvaskulatur9resultiert. Die Mechanismen, die den Regressionsprozess der Hyaloidvaskulatur regulieren, sind kompliziert und breit untersucht. Ein wichtiger molekularer Pfad, der für die normale Regression von Hyaloidgefäßen unerlässlich ist, ist der Wnt-Signalweg10, da genetische Mutationen in diesem Signalweg, die sowohl Wnt-Ligand als auch Rezeptoren betreffen, mit PHPV beim Menschen in Verbindung gebracht wurden9. Experimentelle Studien identifizierten einen Wnt-Ligand, Wnt7b, der durch Makrophagen um Hyaloidgefäße im sich entwickelnden Auge produziert wird, um diesen Regressionsprozess zu vermitteln. Wnt7b aktiviert Die Wnt-Signalisierung durch Bindung mit den Rezeptoren frizzled4 (FZD4)/LRP5 in benachbarten Endothelzellen, um zellapoptose zu initiieren, was zur Regression der Hyaloidgefäße10führt. Als Ergebnis zeigen Wnt7b-Mangelmäuseeine Persistenz von Hyaloidgefäßen10. In ähnlicher Weise bindet ein nicht konventionelles Wnt-Ligand, Norrin (durch das Ndp-Gen kodiert), ebenfalls an FZD4/LRP5, um die Hyaloidgefäßregression während der Entwicklung zu induzieren. Ndpy/-, Lrp5-/-und Fzd4-/- Mäuse zeigen alle verschobene Hyaloidgefäßregression, die eine kritische regulatorische Rolle der Wnt-Signalisierung11,12unterstützt 13,14,15,16. Darüber hinaus überschneidet sich ein anderer Wnt-Corezeptor LRP6 mit LRP5 in seiner Funktion zur Modulation des Wnt-Signalwegs in hyaloiden vaskulären Endothelzellen17. Andere Faktoren, die auch zur Hyaloid-Regression beitragen können, sind der Hypoxie-induzierbare Faktor18,19, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor20,21, Kollagen-1822, 23, Arf24, Angiopoietin-225, und Knochen morphogenetisches Protein-426. In diesem Beitrag verwenden wir Lrp5-/- Mäuse als Modell persistenter Hyaloidgefäße, um die Techniken zur Beurteilung und Charakterisierung der hyaloiden Vaskulatur durch in vivo- und ex vivo-Methoden zu demonstrieren.
Die Visualisierung der hyaloiden Vaskulatur in vivo und ex vivo ist für die Untersuchung der Mechanismen der Hyaloidgefäßregression von wesentlicher Bedeutung. Aktuelle Methoden zur Beobachtung der Hyaloid-Vaskulatur konzentrieren sich hauptsächlich auf die Visualisierung und Analyse von VHP und HA, durch OCT- und FFA-Bilder, Augenquerschnitte und die hyaloide Flachhalterung. OCT und FFA sind leistungsstarke In-vivo-Bildgebungswerkzeuge, die eine Längsbeobachtung bei lebenden Tieren ermöglichen, nachdem sie ihre Augen geöffnet haben. Darüber hinaus bietet die isolierte hyaloide Flachmontage die Visualisierung der gesamten hyaloiden Vaskulatur und ein Mittel, um eine genaue Quantifizierung der Gefäßzahlen zu erreichen. Doch die empfindliche und zerbrechliche Natur der Hyaloidgefäße und die daraus resultierenden technischen Schwierigkeiten seiner Isolierung können seine Verwendung in der Augenforschung etwas eingeschränkt haben10,17,27. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung von Hyaloidgefäßen zur Verfügung, das sowohl in vivo live retinale Bildgebung als auch ex vivo isolierte hyaloide Flachmontage kombiniert, um die Durchführbarkeit dieser Techniken zu verbessern. Dieses Protokoll wurde mit Modifikation und Erweiterung von früheren Veröffentlichungen über die In-vivo-Methode des Live-Fundus und der OCT-Bildgebung28 und die ex vivo-Methode der isolierten hyaloiden Flachhalterung11angepasst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Techniken zur Beurteilung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen sind intuitive und notwendige Verfahren zur Beobachtung der Hyaloidgefäßregression in Tiermodellen, um Studien über die Mechanismen zu ermöglichen, die der gefäßregression während der Entwicklung zugrunde liegen. Während die in vivo retinale Bildgebung die Längsbeobachtung der Hyaloidregression bei demselben Tier ermöglicht, kann der Zugang zu einem Nagetier-Fundus-Bildgebungssystem für OCT und FFA ein begrenzender Faktor sein. Darüber hinau…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 und EY028100) an J.C. Z.W. unterstützt, das von einem Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant unterstützt wurde. Das in dieser Studie beschriebene Hyaloid-Isolationsverfahren wurde mit Änderungen an Protokolle angepasst, die von Drs. Richard Lang, Toshihide Kurihara und Lois Smith großzügig geteilt wurden, denen die Autoren dankbar sind.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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