Évaluation et caractérisation des navires hyaïdis chez les souris
Summary
Ce protocole décrit les méthodes in vivo et ex vivo pour visualiser et caractériser pleinement les vaisseaux hyaloïdes, un modèle de régression vasculaire dans les yeux de souris, utilisant la tomographie de cohérence optique et l’angiographie de fluorescein de fundus pour l’imagerie en direct et ex vivo l’isolement et la monture plate subséquente de hyaloid pour l’analyse quantitative.
Abstract
Dans l’œil, les vaisseaux hyaloid embryonnaires nourrissent la lentille et la rétine en développement et régressent lorsque les vaisseaux rétiniens se développent. La régression persistante ou échouée des vaisseaux hyaloïdes peut être vue dans des maladies telles que le vitré primaire hyperplastique persistant (PHPV), menant à un chemin de lumière obstrué et à la fonction visuelle altérée. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la régression des vaisseaux hyaïdides peut conduire à de nouvelles connaissances moléculaires dans le processus de régression vasculaire et de nouvelles façons potentielles de gérer les maladies avec des vaisseaux hyaloïdes persistants. Ici nous décrivons les procédures pour l’hyaloïde d’imagerie chez les souris vivantes avec la tomographie optique de cohérence (OCT) et l’angiographie de fluorescein de fundus (FFA) et un protocole technique détaillé de l’ex vivo d’hyaloïde isolant et plat-montage pour l’analyse quantitative. Des souris knock-out de protéine 5 (LRP5) liées aux récepteurs de lipoprotéines de faible densité ont été utilisées comme modèle expérimental de vaisseaux hyaloïdes persistants, pour illustrer les techniques. Ensemble, ces techniques peuvent faciliter une évaluation approfondie des vaisseaux hyaloïdes comme modèle expérimental de régression vasculaire et des études sur le mécanisme des vaisseaux hyaloïdes persistants.
Introduction
L’approvisionnement en sang dans l’œil est essentiel pour assurer le développement normal de la rétine et des tissus oculaires environnants et pour équiper une fonction visuelle appropriée. Il y a trois lits vasculaires dans l’oeil : la vascularisation rétinienne, la choroïde, et un réseau circulatoire embryonnaire transitoire des vaisseaux hyaloïdes. Le développement de la vascularisation oculaire nécessite une coordination spatiale et temporelle tout au long de l’embryogenèse et de la maturation des tissus. Parmi les trois lits vasculaires, la vascularisation hyaloïde est le premier système fonctionnel d’approvisionnement en sang à fournir la nutrition et l’oxygène à la lentille embryonnaire nouvellement formée et à la rétine en développement. Les vaisseaux hyaïdis régressent en même temps que les vascularisations de la rétine se développent et mûrissent1. La régression de la vascularisation hyaloïde est essentielle pour permettre une voie visuelle claire pour le développement de la fonction visuelle ; par conséquent, ce processus vasculaire de régression est aussi important que la croissance de la vascularisation rétinienne. La régression hyaloïde altérée peut mener aux maladies d’oeil. En outre, la régression des vaisseaux hyaloïdes fournit un système modèle pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la régression vasculaire, qui peut avoir des implications pour la régulation angiogénique dans d’autres organes aussi bien.
La vascularisation hyaloïde, dérivée de l’artère hyaloïde (HA), est composée de vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL), et de membrane pupillaire (PM). Il fournit la nourriture à la rétine en développement, le vitré primaire, et la lentille pendant le développement embryonnaire2. En provenance de l’HA, VHP branches antérieurement à travers le vitré à la lentille. Le TVL tasse la surface postérieure de la capsule de lentille, et anastomoses au PM, qui se connecte aux artères ciliaires antérieures, couvrant la surface antérieure de la lentille2,3, résultant en la formation d’un réseau de vaisseaux dans le PM 3 (en) , 4 ( en plus) , 5. Il est intéressant de noter qu’il n’y a pas de veines dans la vascularisation hyaloïde, et le système utilise des veines choroïdes pour accomplir le drainage veineux.
Dans l’embryon humain, la vascularisation hyaloïde est presque terminée vers la neuvième semaine de gestation et commence à régresser lorsque les premiers vaisseaux rétiniens apparaissent, au cours du quatrième mois de gestation2. Commençant par l’atrophie du VHP, la régression des réseaux capillaires de la TVL, le PM, et enfin, l’HA se produit par la suite2,3. Pendant ce temps, les rétractations vitrées primaires et le vitreux secondaire commence à se former, composé des composants de matrice extracellulaire, y compris les fibres de collagène. Au sixième mois de gestation, le vitré primaire est réduit à un petit canal transparent s’étendant du disque nerveux optique à la lentille, appelé le canal du Cloquet ou le canal hyaloïde, et le vitré secondaire devient la composante principale du segment postérieur 2 (en) , 3. La circulation hyaloïde disparaît principalement à 35 à 36 semaines de gestation, juste avant la naissance3.
Contrairement aux humains, chez qui la vascularisation hyaloïde est complètement régressée à la naissance, le système vasculaire hyaloid de souris commence à régresser après la naissance. À mesure que la rétine de la souris naît avasculaire et que les vaisseaux rétiniens se développent postnatals, les vaisseaux hyaïdides régressent simultanément du jour postnatal (P) 4 et sont la plupart du temps complètement régressés par P216 (figure 1). Le PM disparaît d’abord entre P10 et P12, et le VHP disparaît entre P12 et P16, tandis qu’un petit nombre de cellules TVL et HA restent même à P16, et par P21 la régression du système vasculaire hyaloïde est presque terminée6. En attendant, la vascularisation rétinienne commence à se développer après la naissance. La couche superficielle du plexus vasculaire s’étend entièrement à la rétine périphérique à P7-P8, la couche profonde (située dans la couche plexiforme externe) se développe à partir de P7-P12, et enfin, le plexus intermédiaire dans la couche plexiforme interne se développe entre P12 et P157 . Au fur et à mesure que la vascularisation rétinienne se développe, elle remplace progressivement la fonction de la régression concomitante des vaisseaux hyaïdïdes, fournissant de la nutrition et de l’oxygène à l’œil en développement. L’occurrence postnatale de la régression des vaisseaux hyaïdïdes chez la souris fournit un modèle expérimental facilement accessible pour observer et étudier la vascularisation hyaloïde, ainsi que la base moléculaire régissant les processus de régression vasculaire sous physiologique et conditions pathologiques8.
L’échec de la régression hyaloïde peut être vu dans les maladies telles que PHPV, qui est une anomalie congénitale rare développementale de l’oeilrésultant d’une régression échouée ou incomplète de la vascularisation embryologique, primaire vitrée et hyaloïde 9. Les mécanismes régulant le processus de régression de la vascularisation hyaloïde sont compliqués et largement étudiés. Une voie moléculaire majeure essentielle pour la régression normale des vaisseaux hyaïdides est la voie de signalisation Wnt10, comme des mutations génétiques dans cette voie affectant à la fois Wnt ligand et les récepteurs ont été liés à PHPV chez l’homme9. Des études expérimentales ont identifié un Wnt ligand, Wnt7b, qui est produit par des macrophages autour des vaisseaux hyaloïdes dans l’œil en développement pour médiation de ce processus de régression. Wnt7b active la signalisation Wnt en se liant avec les récepteurs frizzled4 (FZD4)/LRP5 dans les cellules endothéliales adjacentes pour initier l’apoptose cellulaire, conduisant à la régression des vaisseaux hyaloïdes10. En conséquence, les souris Wnt7b-déficientes montrent une persistance des vaisseaux hyaloïdes10. De même, un Wnt ligand non conventionnel, Norrin (encodé par le gène du Npd), se lie également à FZD4/LRP5 pour induire la régression du vaisseau hyaloïde pendant le développement. Npdy/-, Lrp5-/-, et Fzd4-/- les souris affichent toutes la régression des vaisseaux hyaïdides reportées, soutenant un rôle réglementaire critique de Wnt signalant11,12, 13,14,15,16. En outre, un autre corécepteur Wnt LRP6 chevauche avec LRP5 dans leur fonction sur la modulation de la voie de signalisation Wnt dans les cellules endothéliales vasculaires hyaloid17. D’autres facteurs qui peuvent également contribuer à la régression hyaloid incluent le facteur hypoxia-inductible18,19, facteur de croissance endothéliale vasculaire20,21, collagène-1822, 23, Arf24, angiopoietine-225, et la protéine morphogénétique osseuse-426. Dans cet article, nous utilisons Lrp5-/- souris comme modèle des vaisseaux hyaloïdes persistants pour démontrer les techniques d’évaluation et de caractérisation de la vascularisation hyaloïde par des méthodes in vivo et ex vivo.
La visualisation de la vascularisation hyaloïde in vivo et ex vivo est essentielle pour étudier les mécanismes de la régression des vaisseaux hyaloïdes. Les méthodes actuelles pour observer la vascularisation hyaloïde se concentrent principalement sur la visualisation et l’analyse du VHP et de l’HA, à travers des images OCT et FFA, des sections transversales des yeux et la monture plate hyaloïde. L’OCT et la FFA sont de puissants outils d’imagerie in vivo, permettant l’observation longitudinale chez les animaux vivants après qu’ils ont ouvert les yeux. De plus, la monture plate hyaloïde isolée permet de visualiser l’ensemble de la vascularisation hyaloïde et de fournir une quantification précise du nombre de navires. Pourtant, la nature délicate et fragile des vaisseaux hyaloïdes et les difficultés techniques qui en résultent de son isolement peuvent avoir limité son utilisation dans la recherche oculaire quelque peu10,17,27. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé de la visualisation des vaisseaux hyaloïdes, combinant la formation image rétinienne vivante in vivo et la monture plate hyaloid isolée ex vivo pour améliorer la faisabilité de ces techniques. Ce protocole a été adapté avec la modification et l’expansion des publications précédentes sur la méthode in vivo de base en direct et d’imagerie OCT28 et la méthode ex vivo de la monture plate hyaloïde isolée11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques d’évaluation et de caractérisation des vaisseaux hyaloïdes sont des procédures intuitives et nécessaires pour observer la régression des vaisseaux hyaloïdes dans les modèles animaux, afin de permettre des études sur les mécanismes sous-jacents à la régression vasculaire au cours du développement. Tandis que l’imagerie rétinienne in vivo permet l’observation longitudinale de la régression hyaloïde chez le même animal, l’accès à un système d’imagerie de fonds de rongeur pour OCT et FFA pe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 et EY028100) à J.C. Z.W. a été soutenu par une subvention de démarrage de carrière de la Fondation des Templiers. La procédure d’isolement hyaloïde décrite dans cette étude a été adaptée avec une modification des protocoles généreusement partagés par les Drs Richard Lang, Toshihide Kurihara et Lois Smith, à qui les auteurs sont reconnaissants.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
Riferimenti
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
