הערכה ואפיון של אוניות היאלואיד בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מתאר הן בשיטות הvivo vivo ו-ex כדי להמחיש במלואו ולאפיין את כלי הקיבול, מודל של רגרסיה בכלי הדם בעיני העכבר, באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית ופונדוס fluorescein אנגיוגרפיה עבור הדמיה חיה ולשעבר vivo בידוד ו הר שטוח בעקבות היאלואיד לניתוח כמותי.
Abstract
בעיניים, כלי החיקלואיד העובריים מזינים את העדשות המתפתחות ואת הרשתית ואת הסגת העין כאשר כלי הרשתית להתפתח. רגרסיה מתמשכת או כושלת של כלי היאלואיד ניתן לראות במחלות כגון מתמשך hyperplastic ראשוני אינדקטור (phpv), המוביל נתיב אור חסום ותפקוד חזותי לקוי. הבנת המנגנונים שבבסיס הרגרסיה בכלי ההילואיד עלולה להוביל לתובנות מולקולריות חדשות לתהליך הרגרסיה ולדרכים החדשות הפוטנציאליות לניהול מחלות עם כלי קיבול מתמשך. כאן אנו מתארים את ההליכים להדמיה הדמיה בעכברים חיים עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (OCT) ו הפונדוס fluorescein אנגיוגרפיה (FFA) ו פרוטוקול טכני מפורט של בידוד שטוח הvivo ex לשעבר לניתוח כמותי. בצפיפות נמוכה חלבון ליפופרוטאין קולטן הקשורים חלבונים 5 (LRP5) עכברים שימשו כמודל ניסיוני של כלי היאלואיד מתמשך, כדי להמחיש את הטכניקות. יחד, טכניקות אלה עשוי להקל על הערכה יסודית של כלי היאלואיד כמודל ניסיוני של רגרסיה ומחקרים בכלי הדם על המנגנון של כלי היאלואיד מתמשך.
Introduction
אספקת הדם בעין חיונית כדי להבטיח את ההתפתחות הנורמלית של הרשתית ואת רקמות העין סביב ולצייד פונקציה חזותית נכונה. ישנן שלוש מיטות כלי דם בעין: הרשת הרשתית, הדמית, ומחזור הדם העובריים הארעי של כלי ההילואיד. התפתחותה של העינית מחייבת תיאום מרחבי וזמני לאורך כל embryogenesis והתבגרות רקמות. בין שלוש מיטות כלי הדם, ואצלב היוקלואיד הוא מערכת אספקת הדם התפקודית הראשונה כדי לספק תזונה וחמצן לעדשה העוברית החדשה והרשתית המתפתחת. כלים היאלואיד לסגת באותו הזמן כי הרשתית ובקרה לפתח ובוגרת1. הרגרסיה של היאלואיד ואסיקובלטורה היא מרכזית כדי לאפשר מסלול חזותי ברור לפיתוח של פונקציה חזותית; מכאן, תהליך זה רגרסיה כלי הדם חשוב כמו הצמיחה של ואצלב הרשתית. רגרסיה לקויה עלולה לגרום למחלות עיניים. יתרה מזאת, הרגרסיה של כלי היאלואיד מספקת מערכת מודל לחקירת המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים המעורבים בוויסות רגרסיה בכלי הדם, שעשויה להיות בעלת השלכות גם על הרגולציה האנגיוגנטית באיברים אחרים.
ההילואיד הווקולטורה, שנגזר מעורק היאלואיד (HA), מורכב מוואסה היאלומד (VHP), הטניקה ואסקולוסה (TVL), וממברנה הפפילארי (PM). הוא מספק מזון הרשתית המתפתח, העיקרי והעדשה, ואת העדשות במהלך התפתחות עובריים2. הנובעים מ-HA, סניפים של VHP באים באופן מידי באמצעות הווידוס אל העדשה. ה-tvl כוסות את המשטח האחורי של קפסולת העדשה, ואנסטוסס עד ה-PM, המתחבר לעורקים האחוריים של העדשה, המכסים את המשטח הקדמי של עדשת2,3, וכתוצאה מכך היווצרות רשת של כלי שיט בשעה pm מיכל שלוש , ד , 5. מעניין, אין ורידים ב היוקלואיד, והמערכת עושה שימוש בורידים choroidal כדי להשיג ניקוז ורידים.
בעובר האנושי, היוקלואיד ולטבלטורה כמעט מושלם במהלך השבוע התשיעי של ההיריון ומתחיל לסגת כאשר כלי הרשתית הראשונים מופיעים, בחודש הרביעי של ההיריון2. החל מניוון של vhp, רגרסיה של רשתות קפילר של tvl, the PM, ולבסוף, HA מתרחשת לאחר מכן2,3. בינתיים, המופרע הזה בו העיקרית והוויראוס המשני מתחיל להיווצר, המורכב מרכיבי מטריקס מתכלים, כולל סיבי קולגן. עד החודש השישי של ההיריון, הטיפול העיקרי הוא מופחת לתעלת שקוף קטנה המשתרעת מדיסק העצב האופטי אל העדשה, המכונה תעלת Cloquet או תעלת היאלואיד, ואת הוויריאוס המשני הופך את המרכיב העיקרי של הקטע האחורי מיכל השני , 3. מחזור ההיאלואיד נעלם בעיקר ב 35 כדי 36 שבועות של ההיריון, ממש לפני הלידה3.
בניגוד לבני האדם, אשר היאלואיד ואסיקולטורה הוא לגמרי בנסיגה בלידה, מערכת כלי הדם של העכבר מתחיל לסגת לאחר הלידה. כמו הרשתית העכבר נולד נמק העצם ואת כלי הרשתית לפתח postnatally, כלי היאלואיד נסיגה במקביל ביום האחרי לידה (P) 4 הם בעיקר לגמרי בנסיגה על ידי P216 (איור 1). PM נעלמת הראשון בין P10 ו P12, ו-VHP נעלמת בין P12 ו P16, בעוד מספר קטן של תאים TVL ו HA להישאר אפילו ב P16, ועל ידי P21 הרגרסיה היאלואלואיד מערכת כלי הדם הוא כמעט השלמת6. בינתיים, הוזוקולטורה הרשתית מתחיל להתפתח לאחר הלידה. השכבה השטחית של מקלעת כלי הדם מרחיבה לחלוטין את הרשתית ההיקפית ב-P7 – P8, השכבה העמוקה (הממוקמת בשכבה הplexiform החיצונית) מתפתחת מP7 – P12, ולבסוף, מקלעת הביניים בשכבת הplexiform הפנימית מתפתחת בין P12 ל-P157 . כפי שמתפתח הרשתית, היא מחליפה בהדרגה את הפונקציה של כלי הקיבול ה, המספק תזונה וחמצן לעין המתפתחת. מופע הפוסט-לידה של רגרסיה ספינת היאלואיד בעכברים מספק מודל ניסיוני נגיש בקלות כדי להתבונן וללמוד את הוזוקובלטורה, כמו גם את הבסיס המולקולרי המסדירים תהליכים רגרסיה בכלי דם תחת שניהם פיסיולוגיים וגם תנאים פתולוגיים8.
כישלון רגרסיה hyaloid ניתן לראות מחלות כגון phpv, שהיא סטייה נדירה התפתחותית מולדים של העין וכתוצאה מרגרסיה כושלת או שאינה מלאה של embryological, הראשי אינדקטור ו היאלוקוד9. המנגנונים המסדירים את תהליך הרגרסיה של היאלואיד מסובכים ולמדו בהרחבה. אחד השביל המולקולרי העיקרי חיוני הרגרסיה הרגילה של כלי היאלואיד הוא מסלול ה-wnt איתות10, כמו מוטציות גנטיות במסלול זה להשפיע על wnt ליגנד קולטנים היו מקושרים עם phpv בבני אדם9. מחקרים ניסיוניים זיהו Wnt ligand, Wnt7b, אשר מופק על ידי מקרופאגים סביב כלי היאלואיד בעין המתפתחת כדי לתווך את תהליך הרגרסיה. Wnt7b מפעיל איתות Wnt על-ידי איגוד עם הקולטנים frizzled4 (FZD4)/LRP5 בתאי אנדותל סמוכים כדי ליזום אפופטוזיס תאים, המוביל לרגרסיה של כלי היאלוקוד10. כתוצאה מכך, עכברים לקויה Wnt7bלהראות התמדה של כלי היאלואיד10. באופן דומה, Wnt ליגנט לא קונבנציונאלי, Norrin (מקודד על ידי הגנים Ndp ), גם נקשר FZD4/LRP5 כדי לגרום הרגרסיה היפאלואיד ספינה במהלך הפיתוח. Ndpy/-, Lrp5-/-, ו –Fzd4-/- עכברים כולם להציג את הרגרסיה היאלואלואיד בספינה, תמיכה בתפקיד רגולטורי קריטי של wnt איתות11,12, 13,14,15,16. יתר על כן, Wnt coreceptor LRP6 חופפים עם LRP5 בתפקוד שלהם על מודלדירוג מסלול האיתות Wnt בתוך כלי הדם שלהיאלוקוד וסקולתל. גורמים אחרים שעשויים גם לתרום לרגרסיה היאלואיד כוללים את היפוקסיה-inducible factor18,19, גורם הגדילה של כלי הדם20,21, קולגן-1822, 23, arf24, אנגיופיאה-225, ו העצם מורמורגנטית חלבון-426. במאמר זה, אנו משתמשים Lrp5-/- עכברים כמודל של כלי היאלואיד מתמשך כדי להדגים את הטכניקות של הערכה והאפיון והשיטה באמצעות שיטות vivo ולשעבר vivo.
ההדמיה של היאלוקוד ואסילטורה ב vivo ו ex vivo הוא חיוני ללמוד את המנגנונים של רגרסיה ספינת היאלואיד. שיטות נוכחיות להתבונן היאלוקוד ואסיקובלטורה בעיקר להתמקד על המחשה וניתוח של VHP ו HA, באמצעות התמונות OCT ו FFA, הצלב העין סעיפים, ו-hyaloid שטוח הר. OCT ו-FFA הם בעלי עוצמה בכלי הדמיה vivo, המאפשרים התבוננות מרבית בבעלי חיים חיים לאחר שפתחו את עיניהם. יתר על כן, מבודד hyaloid שטוח הר מספק ויזואליזציה של הואלואיד כולו ואמצעי להשגת כימות מדויקת של מספרי כלי. ובכל זאת, האופי העדין והשברירי של כלי הדם והקשיים הטכניים הנובעים מהבידוד שלו עשויים להגביל את השימוש במחקרי עיניים במידת מה10,17,27. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של ויזואליזציה של כלי היאלואיד, שילוב הן ב vivo live הדמיה רשתית ו לשעבר vivo בודד hyaloid שטוח הר כדי לשפר את הכדאיות של טכניקות אלה. פרוטוקול זה הותאם עם שינוי והתרחבות מפרסומים קודמים על השיטה vivo של הפונדוס חי הדמיה OCT28 ואת השיטה ex vivo של מבודד hyaloid שטוח הר11.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות כדי להעריך ולאפיין את כלי הקיבול הם הליכים אינטואיטיבי והכרחי כדי לבחון את הרגרסיה ספינת היאלואיד בדגמי בעלי חיים, כדי לאפשר מחקרים על המנגנונים המשמשים את רגרסיה כלי הדם במהלך הפיתוח. בעוד הדמיה ברשתית vivo מאפשר תצפית האורך של רגרסיה hyaloid באותה חיה, גישה מערכת הדמיה פונדוס מכרסם ע?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים (R01 EY024963 ו EY028100) כדי J.C. Z.W. נתמך על ידי אבירים הטמפלרים עין הקריירה הראשונית גרנט. הליך הבידוד של היאלואיד המתואר במחקר זה הותאם עם שינוי מתוך פרוטוקולים בנדיבות משותפת של ד ר. ריצ’רד לאנג, Toshihide קוריהארה, ולואיס סמית ‘, למי המחברים אסירי תודה.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
Riferimenti
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
