Bedömning och karakterisering av Hyaloida kärl hos möss
Summary
Detta protokoll beskriver både in vivo och ex vivo metoder för att fullt visualisera och karakterisera hyaloid fartyg, en modell av vaskulär regression i mus ögon, med hjälp av optisk koherens tomografi och fundus fluorescein angiografi för levande Imaging och ex vivo isolering och efterföljande platt fäste av hyaloid för kvantitativ analys.
Abstract
I ögat, de embryonala hyaloid fartygen ger näring åt att utveckla linsen och näthinnan och regrediera när näthinnans kärl utvecklas. Ihållande eller misslyckad regression av hyaloid fartyg kan ses vid sjukdomar som ihållande hyperplastiska primära glaskroppen (PHPV), vilket leder till en blockerad ljus Stig och försämrad visuell funktion. Förstå mekanismerna bakom hyaloid Vessel regression kan leda till nya molekylära insikter i den vaskulära Regressions processen och potentiella nya sätt att hantera sjukdomar med ihållande hyaloid fartyg. Här beskriver vi procedurerna för avbildning hyaloid i levande möss med optisk koherens tomografi (ULT) och fundus fluorescein angiografi (FFA) och ett detaljerat tekniskt protokoll för isolering och platt-montering hyaloid ex vivo för kvantitativ analys. Low-density lipoprotein receptor-relaterat protein 5 (LRP5) knockout möss användes som en experimentell modell av ihållande hyaloid fartyg, för att illustrera teknikerna. Tillsammans kan dessa tekniker underlätta en grundlig bedömning av hyaloid fartyg som en experimentell modell av vaskulär regression och studier på mekanismen för ihållande hyaloid fartyg.
Introduction
Blodtillförseln i ögat är viktigt för att säkerställa den normala utvecklingen av näthinnan och omgivande ögon vävnader och att utrusta en ordentlig visuell funktion. Det finns tre vaskulära bäddar i ögat: retinal vasculature, åderhinnan, och ett övergående embryonala cirkulations nätverk av hyaloid fartyg. Utvecklingen av den okulära vaskulaturen kräver rumslig och tidsmässig koordination genom embryogenes och vävnads mognad. Bland de tre vaskulära sängarna är hyaloid kärlsystemet den första funktionella blod försörjningssystem för att ge näring och syre till den nybildade embryonala linsen och utveckla näthinnan. Hyaloid fartyg regrediera samtidigt som näthinnan vasculatures utvecklas och mogna1. Regression av hyaloid kärlsystemet är avgörande för att möjliggöra en tydlig visuell väg för utveckling av visuell funktion; Därför är denna vaskulär regression process lika viktigt som tillväxten av retinal vasculature. Försämrad hyaloid regression kan leda till ögonsjukdomar. Dessutom ger regression av hyaloid fartyg ett modellsystem för att undersöka cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i regleringen av vaskulär regression, som kan ha konsekvenser för angiogena regleringen i andra organ samt.
Den hyaloid vaskulatur, som härrör från hyaloid artär (ha), består av Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa lentis (TVL), och pupill membran (PM). Det ger näring till den växande näthinnan, den primära glaskroppen, och linsen under embryonal utveckling2. På grund av HA, grenar VHP anteriorly genom glaskroppen till linsen. Den TVL koppar den bakre ytan av linsen kapseln, och anastomoser till PM, som ansluter till den främre ciliär artärer, som täcker den främre ytan av linsen2,3, vilket resulterar i bildandet av ett nätverk av fartyg i PM 3 , 4 , 5. intressant, det finns inga vener i hyaloid vasculature, och systemet använder sig av koroidal vener att utföra venös dränering.
I det mänskliga embryot, den hyaloid kärlsystemet är nästan klar på ungefär den nionde graviditetsveckan och börjar regrediera när de första retinala fartyg visas, under den fjärde månaden av dräktifiering2. Börjar med atrofi av VHP, regression av kapillära nätverk av TVL, PM, och slutligen, ha inträffar därefter2,3. Under tiden börjar den primära glaskroppen dras in och den sekundära glaskroppen bildas, sammansatt av de extracellulära matrix komponenter, inklusive kollagenfibrer. Genom den sjätte graviditetsmånaden, den primära glaskroppen reduceras till en liten transparent kanal som sträcker sig från synnerven skivan till linsen, kallas Cloquet kanal eller hyaloid kanalen, och den sekundära glaskroppen blir den viktigaste komponenten i den bakre segmentet 2 , 3. den hyaloid cirkulationen försvinner mestadels på 35 till 36 graviditetsveckor, strax före födseln3.
Till skillnad från människor, där hyaloid kärlsystemet är helt regredierat vid födseln, musen hyaloid kärlsystemet börjar regrediera efter födseln. Eftersom musen näthinnan föds avaskulära och retinala fartyg utvecklas postnatalt, hyaloid fartyg regrediera samtidigt från postnatal dag (P) 4 och är oftast helt regredierat av P216 (figur 1). PM försvinner först mellan P10 och P12 och VHP försvinner mellan P12 och P16, medan ett litet antal TVL-och HA-celler finns kvar även på P16, och med P21 är hyaloid vaskulär system regression nästan komplett6. Under tiden börjar retinal kärlsystemet utvecklas efter födseln. Det ytliga skiktet av vaskulär plexus sträcker sig helt till den perifera näthinnan vid P7-P8, det djupa skiktet (beläget i den yttre plexiform skiktet) utvecklas från P7-P12, och slutligen, den mellanliggande plexus i inre plexiform skiktet utvecklas mellan P12 och p157 . Som retinal kärlsystemet utvecklar, det gradvis ersätter funktionen av samtidigt tillbakagång hyaloid fartyg, ger näring och syre till att utveckla ögat. Den postnatala förekomsten av hyaloid Vessel regression hos möss ger en lättillgänglig experimentell modell för att observera och studera den hyaloida vaskulaturen, samt den molekylära basen som reglerar kärl Regressions processer under både fysiologiska och patologiska tillstånd8.
Fel på hyaloid regression kan ses vid sjukdomar som phpV, vilket är en sällsynt medfödd utveckling anomali i ögat till följd av en misslyckad eller ofullständig regression av embryologiska, primära glaskroppen och hyaloid kärlsystemet9. Mekanismerna som reglerar Regressions processen för hyaloid kärlsystemet är komplicerade och studeras i stor utsträckning. En stor molekyl väg som är nödvändig för den normala regressionen av hyaloid-kärl är WNT-signalvägen10, eftersom genetiska mutationer i denna väg som påverkar både WNT-ligand och receptorer har kopplats till phpV hos människor9. Experimentella studier identifierade en WNT ligand, Wnt7b, som produceras av makrofager runt hyaloid fartyg i utvecklingsländerna ögat att medla denna Regressions process. Wnt7b aktiverar WNT signalering genom att binda med receptorerna frizzled4 (FZD4)/LRP5 i angränsande endotelceller att initiera Cell apoptos, vilket leder till regression av hyaloid fartyg10. Som ett resultat, Wnt7b-brist möss visar en uthållighet av hyaloid fartyg10. På samma sätt binder en icke-konventionell WNT ligand, Norrin (kodad av NDP -genen), också till FZD4/LRP5 för att inducera hyaloid Vessel regression under utvecklingen. NDPy/-, Lrp5-/-, och Fzd4-/- möss alla Visa uppskjuten hyaloid Vessel regression, stödja en kritisk reglerande roll WNT signalering11,12, 13,14,15,16. Dessutom, en annan WNT coreceptor LRP6 överlappar med LRP5 i sin funktion på modulerande WNT signalering väg i hyaloid vaskulära endotelceller17. Andra faktorer som också kan bidra till hyaloid regression inkluderar hypoxi-inducerbar faktor18,19, vaskulär endotelial tillväxtfaktor20,21, kollagen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, och ben morfogenetiska protein-426. I detta dokument använder vi Lrp5-/- möss som en modell av ihållande hyaloid fartyg för att demonstrera teknikerna för att bedöma och karakterisera hyaloid kärlsystemet genom både in vivo-och ex vivo-metoder.
Visualisering av hyaloid kärlsystemet in vivo och ex vivo är avgörande för att studera mekanismerna för hyaloid Vessel regression. Nuvarande metoder för att observera hyaloid kärlsystemet fokuserar främst på att visualisera och analysera VHP och ha, genom Oct och FFA bilder, öga tvärsnitt, och hyaloid Flat Mount. OCT och FFA är kraftfulla in vivo imaging verktyg, vilket möjliggör longitudinell observation i levande djur efter att de har öppnat sina ögon. Dessutom ger isolerade hyaloid Flat Mount visualisering av hela hyaloid kärlsystemet och ett sätt att uppnå en korrekt kvantifiering av fartygsnummer. Men den känsliga och bräckliga karaktären hos hyaloid fartyg och de resulterande tekniska svårigheterna med dess isolering kan ha begränsat dess användning i ögonforskning något10,17,27. I detta dokument ger vi ett detaljerat protokoll för visualisering av hyaloid fartyg, som kombinerar både in vivo Live retinal Imaging och ex vivo isolerade hyaloid Flat Mount för att förbättra genomförbarheten av dessa tekniker. Detta protokoll har anpassats med modifiering och expansion från tidigare publikationer om in vivo-metoden för levande fundus och OCT Imaging28 och ex vivo-metoden för isolerade hyaloid Flat Mount11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoder för att bedöma och karakterisera hyaloid-kärl är intuitiva och nödvändiga procedurer för att iaktta hyaloid Vessel regression i djurmodeller, för att möjliggöra studier av mekanismerna bakom vaskulär regression under utvecklingen. Medan in vivo retinal Imaging möjliggör longitudinell observation av hyaloid regression i samma djur, kan tillgång till en gnagare fundus Imaging system för OCT och FFA vara en begränsande faktor. Dessutom är in vivo Imaging i levande möss inte möjligt innan de öppna…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag (R01 EY024963 och EY028100) till J.C. Z.W. stöddes av en Tempelherreorden Eye Foundation karriär starter Grant. Den hyaloid isolering förfarande som beskrivs i denna studie anpassades med modifiering från protokoll generöst delas av DRS. Richard Lang, Toshihide Kurihara, och Lois Smith, som författarna är tacksamma.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
Riferimenti
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
