Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.
Abstract
Die adulte Neurogenese ist ein dynamischer Prozess, bei dem neu aktivierte neuronale Stammzellen (NSCs) in der subgranularen Zone (SGZ) des Dentatgyrus (DG) neue Neuronen erzeugen, die sich in einen bestehenden neuronalen Kreislauf integrieren und zu spezifischen Hippocampusfunktionen beitragen. . Wichtig ist, dass die adulte Neurogenese sehr anfällig für Umweltreize ist, die eine aktivitätsabhängige Regulierung verschiedener kognitiver Funktionen ermöglichen. Eine breite Palette von neuronalen Schaltkreisen aus verschiedenen Gehirnregionen orchestriert diese komplexen kognitiven Funktionen. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie bestimmte neuronale Schaltkreise die Adult Neurogenese regulieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Manipulation der Aktivität neuronaler Schaltkreise mit Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) Technologie aktiviert werden, die NSCs und neugeborene Nachkommen bei Nagetieren reguliert. Dieses umfassende Protokoll umfasst die stereotaxic-Injektion von Viruspartikeln, die chemogenetische Stimulation bestimmter neuronaler Schaltkreise, die analoge Verabreichung von Thymidin, die Gewebeverarbeitung, die Immunfluoreszenzkennzeichnung, die konfokale Bildgebung und die Bildgebung. Analyse verschiedener Stadien neuronaler Vorläuferzellen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zu Antigen-Retrieval-Techniken zur Visualisierung von NSCs und deren Nachkommen und beschreibt eine einfache, aber effektive Möglichkeit, Gehirnkreise mit Clozapin-N-Oxid (CNO) oder CNO-haltigem Trinkwasser zu modulieren und DREADDs-exzierende Viren. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Anpassungsfähigkeit, eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen, die die von NSCs abgeleitete Adult Neurogenese beeinflussen.
Introduction
Adult Neurogenesis ist ein biologischer Prozess, durch den neue Neuronen in einem Erwachsenen geboren und in die bestehenden neuronalen Netzwerke integriert werden1. Beim Menschen findet dieser Prozess im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus statt, wo täglich etwa 1.400 neue Zellen geboren werden2. Diese Zellen befinden sich im inneren Teil der DG, der eine neurogene Nische, die so genannte subgranulare Zone (SGZ), beherbergt. Hier durchlaufen hippocampale adulte neuronale Stammzellen (NSCs) einen komplexen Entwicklungsprozess, um voll funktionsfähige Neuronen zu werden, die zur Regulierung spezifischer Gehirnfunktionen beitragen, einschließlich Lernen und Gedächtnis, Stimmungsregulierung und Stressreaktion3 ,4,5,6. Um das Verhalten zu beeinflussen, werden erwachsene NSCs durch verschiedene externe Reize in einer aktivitätsabhängigen Weise stark reguliert, indem sie auf eine Reihe lokaler und distaler chemischer Hinweise reagieren. Diese chemischen Hinweise umfassen Neurotransmitter und Neuromodulatoren und handeln in einer Schaltung spezifische Weise aus verschiedenen Gehirnregionen. Wichtig ist, dass die kreisweite Konvergenz dieser chemischen Hinweise auf NSCs eine einzigartige und präzise Regulierung von Stammzellaktivierungs-, Differenzierungs- und Schicksalsentscheidungen ermöglicht.
Eine der effektivsten Möglichkeiten, die Schaltungsregulierung von erwachsenen NSCs in vivo abzuhören, besteht darin, die Immunfluoreszenzanalyse mit kreisweiten Manipulationen zu koppeln. Die Immunfluoreszenzanalyse von nSCs für Erwachsene ist eine häufig verwendete Technik, bei der Antikörper gegen bestimmte molekulare Marker verwendet werden, um das Entwicklungsstadium von nSCs für Erwachsene anzuzeigen. Zu diesen Markern gehören: Nestin als radiale Gliazelle und früher neuronaler Vorläufermarker, Tbr2 als zwischengeschalteter Vorläufermarker und dcx als Neuroblast und unreifer Neuronenmarker7. Zusätzlich können durch die Verabreichung von Thymidin-Analogen wie BrdU, CidU, Idu und Edu Zellpopulationen, die sich der S-Phase unterziehen, individuell beschriftet und visualisiert werden8,9,10. Durch die Kombination dieser beiden Ansätze kann eine breite Palette von Fragen untersucht werden, die von der Art und Weise, wie die Proliferation in bestimmten Entwicklungsstadien reguliert wird, bis hin zur Wirkung verschiedener Hinweise auf die NSC-Differenzierung und Neurogenese reichen.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, neuronale Schaltkreise effektiv zu manipulieren, einschließlich elektrischer Stimulation, Optogenetik und Chemogenetik, jeder mit seinen eigenen Vor- und Nachteilen. Die elektrische Stimulation beinhaltet eine umfangreiche Operation, bei der Elektroden in eine bestimmte Hirnregion implantiert werden, die später verwendet werden, um elektrische Signale zu übertragen, um eine zielgerichtete Hirnregion zu modulieren. Dieser Ansatz fehlt jedoch sowohl der zellulären als auch der Schaltungssspezifität. Optogenetik beinhaltet die Lieferung von viralen Partikeln, die einen Licht-aktivierten Rezeptor kodieren, der durch einen Laser stimuliert wird, der durch eine implantierte optische Faser emittiert wird, aber umfangreiche Manipulationen, hohe Kosten und komplexe Operationen erfordert11. Chemogenetik beinhaltet die Abgabe von Viruspartikeln, die einen Designerrezeptor kodieren, der ausschließlich durch Designermedikamente oder DREADDs aktiviert wird, die anschließend durch einen spezifischen und biologisch inerten Liganden, bekannt als Clozapin-N-Oxid (CNO)12, aktiviert werden. . Der Vorteil der Verwendung von DREADDs zur Manipulation lokaler neuronaler Schaltkreise, die erwachsene NSCs regulieren, liegt in der Leichtigkeit und den verschiedenen Wegen der CNO-Administration. Dies ermöglicht einen weniger zeitaufwändigen Ansatz mit reduzierter Tierhandhabung, der für Langzeitstudien leicht anpassungsfähig ist, um neuronale Schaltkreise zu modulieren.
Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz ist eine umfassende Sammlung verschiedener Protokolle, die erforderlich sind, um die Schaltkreisregulierung der erwachsenen Hippocampus-Neurogenese erfolgreich abzuhören, die sowohl Immunfluoreszenztechniken als auch Schaltungsmanipulationen kombiniert. Chemogenetik. Die im folgenden Protokoll beschriebene Methode eignet sich zur Stimulierung oder Hemmung eines oder mehrerer Schaltkreise gleichzeitig in vivo, um ihre regulatorische Funktion auf die adulte Neurogenese zu bestimmen. Dieser Ansatz wird am besten verwendet, wenn die Frage nicht ein hohes Maß an zeitlicher Auflösung benötigt. Fragen, die eine präzise zeitliche Kontrolle der Stimulation/Hemmung bei einer bestimmten Frequenz erfordern, können besser mit der Optogenetik13,14behandelt werden. Der hier beschriebene Ansatz ist leicht für Langzeitstudien mit minimalem Umgang mit Tieren geeignet, insbesondere dort, wo Stress ein großes Anliegen ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren einschließlich tierischer Fächer wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina Chapel Hill genehmigt.
1. Stereotaxic Injektion von Viralpartikeln
- Bestimmen Sie die betreffenden neuronalen Schaltkreise. Dadurch wird der Virus und die Mauslinie für das folgende Verfahren verwendet bestimmt.
HINWEIS: Für dieses Beispiel werden kontralaterale Mooszellprojektionen stimuliert, um seine Auswirkungen auf die adulte Neurogenese zu analysieren. Virale Partikel, die AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry kodieren, werden an die DG von 5ht2A-Cre Mäusen15geliefert. - Präoperanung mindestens 30 min Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) zu verabreichen, um einer 8 Wochen alten männlichen heterozygoten 5ht2A-Cre Maus eine präventive Analgesie zu bieten.
- Anästhesisieren Sie die Maus mit einem 4% Isofluran-Sauerstoffgemisch, bis seine Atmung verlangsamt und die Maus mit einer Isoflurankammer bewusstlos ist. Zehen kneifen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie nicht reagiert.
- Legen Sie die Maus in die Stereosteuer auf ein kleines Tier Heizpad für die thermische Regulierung und wenden Sie Augenschmierstoff auf jedes Auge. Reduzieren Sie Isofluran auf 1,5%, sobald sich das Tier in der Stereosteuer befindet.
HINWEIS: Die Platzierung der Ohrstange in dieser Phase ist wichtig. Stellen Sie sicher, dass der Kopf nach der Ohrstangenplatzierung eben ist. Ausführlichere Anweisungen finden Sie in Geiger et al.16. - Legen Sie Haarentfernung Produkt auf den Kopf und lassen Sie es für bis zu 1 min maximal sitzen. Entfernen Sie das Haar, indem Sie den Kopf mit Ethanoltüchern abwischen. Wenn das Haar nicht vollständig entfernt wird, wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Oberseite des Kopfes haarlos ist.
- Desinfizieren Sie den haarlosen Bereich mindestens 3 Mal mit einer Povidon-Jod-Lösung.
- Legen Sie topische Lidocain-Lösung auf die haarlose Haut des Kopfes und warten Sie 1 min. Entfernen Sie topische Lidocain aus dem Kopf und machen Sie einen kleinen Schnitt auf dem Kopf vom Anfang der Augen bis zum Anfang der Ohren ca. 2 mm mit einem chirurgischen Skalpell.
HINWEIS: Zehen kneifen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie vollständig sediert ist, bevor Sie irgendwelche Schnitte machen. - Ziehen Sie die Kopfhaut zurück und reinigen Sie das Bindegewebe auf der Oberseite des Kopfes, indem Sie sterilisierte Wattestäbchen verwenden, bis das Bregma leicht identifizierbar ist.
- Suchen Sie das Bregma und stellen Sie den Kopf so ein, dass sich Bregma und Lambda beide auf derselben Ebene befinden, indem Sie den Bohrer an beiden Koordinaten platzieren und sich versichern, dass sie ausgerichtet sind. Richten Sie außerdem die linke und rechte Hemisphäre aus, indem Sie den Bohrer links/rechts in einem Bereich zwischen Bregma und Lambda platzieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig; falsch ausgerichtete Kopfplatzierung stört stereotaxic-Koordinaten. - Bohren Sie die folgenden Koordinaten aus Bregma mit einem 0,5 mm Bohrer: vordere Hinterachse (AP) -2,00 mm, mediale Seitenachse (ML) +1,50 mm. Machen Sie ein Bohrloch mit einem Durchmesser von 0,5 mm bis 1 mm.
HINWEIS: Ändern Sie diesen Schritt mit Koordinaten, die für die betreffende Schaltung spezifisch sind. Dieses Beispiel zielt auf einen einseitigen Dentat-Gyrus ab, der moosige Zellen enthält, und bestimmt deren Wirkung auf adulte neuronale Stammzellen auf der kontralateralen Seite. - Schalterbohrer auf 5 l Spritze und 26-33 G Nadel. Null bei Bregma und dann injizieren an den folgenden Koordinaten, indem die Nadel in das Bohrloch an der vorderen hinteren Achse -2,00 mm, mediale Seitenachse -1,50 mm, dorsale ventrale Achse -2,3 mm.
- Infuse 500 nL des Adeno-assoziierten Virus (AAV) von einem viralen Kern oder kommerzieller Quelle auf die entsprechende Hemisphäre, bei 50 x 100 nL/min mit einer Infusionspumpe (Tabelle der Materialien). Warten Sie mindestens 5 min nach der Injektion, bevor Sie die Nadel langsam aus dem Gehirn entfernen.
HINWEIS: Diese Koordinaten können basierend auf dem Alter und der Größe der Maus angepasst werden. Bestimmte virale Serotypen haben unterschiedliche Diffusionsmuster, es ist am besten, Pilotversuche durchzuführen, um die virale Ausbreitung vor einem vollständigen Experiment zu testen. - Reinigen Sie Kopfhaut und Haut um Schnitt mit Saline, dann versiegeln Schnitt mit Gewebekleber (Tabelle der Materialien) während die Haut zusammen mit Pinzette zu halten. Führen Sie alle postoperativen Verfahren wie die Überwachung während der Erholung auf einem Heizkissen durch, bis die Maus aktiv ist, wenden Sie Schmerzmittel auf die Wunde an und verabreicht Sie zwei Tage lang Schmerzmittel.
HINWEIS: Viele Experimente benötigen 2 bis 4 Wochen Wartezeit nach viraler Infusion für die richtige virale Expression.
2. Clozapin N-Oxid-Verabreichung
- Bereiten Sie eine CNO-Lösung vor, indem Sie 10 mg CNO in 100 l Dimethylsulfoxid (DMSO) und Wirbel lösen.
HINWEIS: Wenn sich die Lösung nicht vollständig auflöst, erhöhen Sie das Volumen von DMSO, aber zu viel DMSO kann das Wasser bitter machen. Nicht mehr als 0,1% DMSO in CNO-Wasserlösung oder mehr als 200 l DMSO für eine 200 ml Lösung. Die CNO-Lagerlösung kann bis zu zwei Wochen bei -20 °C gelagert werden. - Fügen Sie jede 200 ml Wasserlösung mit einer Gesamtkonzentration von 1x5 mg/200 ml zu einer Gesamtkonzentration von 1 x 5 mg/200 ml hinzu. Bereiten Sie die CNO-Wassermischung jeden Tag frisch vor.
HINWEIS: Einige Gruppen haben bis zu 1% Saccharin im Wasser ergänzt, um Bitterkeit zu maskieren, wenn Mäuse auf das Trinken verzichten. Die untersuchte Schaltung zeigte eine andere Reaktion basierend auf dem Grad der Aktivierung. Im Allgemeinen reichen 1 mg CNO/200 ml aus, um die meisten Schaltkreise zu stimulieren17. - Legen Sie die CNO-Lösung bei der Verabreichung an Mäuse zwei Wochen nach der Genesung von der stereotaxic-Injektion ab Schritt 1.13 über einen Zeitraum von 4 Tagen in einen folienbedeckten oder lichtgeschützten Behälter.
HINWEIS: CNO ist lichtempfindlich; Während des gesamten Prozesses die Lichtexposition zu reduzieren. - Messen und aufzeichnen Sie verbrauchte CNO-Wasserlösung jeden Tag bei der Zubereitung frischer CNO-Lösung. Im Durchschnitt verbraucht eine erwachsene Maus etwa 4 ml CNO-Wassergemisch. Zeichnen Sie außerdem das Mausgewicht täglich auf, um sicherzustellen, dass sie trinken.
- Stellen Sie sicher, dass für jedes Experiment die richtigen Steuerelemente verwendet werden. Schließen Sie sowohl ein CNO- als auch ein DREADD-Steuerelement ein. Ein Beispiel für einen Versuchsaufbau wäre: (1) Fahrzeug + autonomes Amphibienfahrzeug (AAV) mit viralem Reporter kein DREADD, (2) CNO + AAV mit viralem Reporter ohne DREADD und (3) CNO + AAV DREADD.
HINWEIS: Alle Gruppen enthalten DMSO in der Lösung. DMSO-Kontrollen sind nicht enthalten, da Tiere weniger als 0,1% DMSO erhalten, was nachweislich keine nachteiligen Auswirkungen auf adulte neuronale Stammzellen bei Mäusen hat. Wenn es Bedenken bezüglich der DMSO-Verwendung im Trinkwasser gibt, fügen Sie eine zusätzliche keine DMSO- und Salzkontrolle hinzu.
3. Thymidin Analog Etikettierung
-
Am Tag der Gewebesammlung, 4 Tage nach der Verabreichung von CNO, beschriften Sie vermehrende Zellen, indem Sie eine Reihe von Thymidin-Analog-, 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (Edu) intraperitonealen Injektionen durchführen.
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet Edu. Es gibt jedoch mehrere Thymidin-Analoga, die wuelende Zellpopulationen wie Brdu, Idu und Cidu8effizient kennzeichnen können.- Wiegen Sie Edu und lösen Sie in tierärztlicher Klasse 0,9% Natriumchlorid-Injektionslösung bei 4 mg/ml durch Wirbeln und Auflegen auf einen Rotor für 15 min.
HINWEIS: Thymidin Analoga sind giftig und lichtempfindlich. Befolgen Sie material safety data sheets (MSDS) bei der Handhabung und Abdeckung von Lösungen vor Lichtbelichtung mit Aluminiumfolie. - Edu intraperitoneal bei 40 mg/kg oder 0,1 ml/10 g Körpergewicht der 4 mg/ml Edu-Lösung 4 mal alle 2 h verabreichen.
HINWEIS: Dosen über 50 mg/kg erreichen in der Nähe von Sättigungsniveaus und erhöhen nicht die Menge der markierten proliferierenden Zellen deutlich18. Es ist entscheidend, dass alle Mäuse die gleiche Menge an Edu-Injektionen erhalten, da unsachgemäße Etikettierung die Ergebnisse verzerren kann.
- Wiegen Sie Edu und lösen Sie in tierärztlicher Klasse 0,9% Natriumchlorid-Injektionslösung bei 4 mg/ml durch Wirbeln und Auflegen auf einen Rotor für 15 min.
4. Gewebevorbereitung und -verarbeitung
- Zwei Stunden nach der letzten Edu-Injektion, befeuchten Sie die Maus mit einer Isofluran-Kammer, bis die Atmung deutlich reduziert ist und Zehenkneifen, um sicherzustellen, dass es vollständig sediert ist.
- Sichern Sie die Maus an der Oberfläche mit Nadeln und machen Sie einen kleinen Schnitt, der das Herz aussetzt. Legen Sie eine 25 G Nadel auf die linke Aorta und schneiden Sie den rechten Ventrikel für die transkardiale Perfusion mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) Lösung mit einer Durchflussrate von 1 x 4 ml/min, bis Lebergewebe gereinigt ist.
- Schalten Sie die Perfusionslösung auf 4% Paraformaldehyd (PFA) und durchdringen Sie etwa 15 bis 20 ml, um Hirngewebe zu fixieren.
HINWEIS: Ausführlichere Anweisungen zum Perfusionsprozess finden Sie in Gage et al.19. Tierzittern wird beobachtet, wenn sie richtig gemacht werden. - Entfernen Sie den Kopf mit einer großen Schere und führen Sie dann eine Reihe von sorgfältigen Schnitte, um das Gehirn aus dem Schädel zu befreien. Speichern Sie Hirngewebe bei 4 °C in 4% PFA über Nacht, um die Fixierung fortzusetzen.
- Entfernen Sie das Hirngewebe aus 4% PFA-Lösung und legen Sie es in eine 10%ige Saccharoselösung in PBS, um Gewebe 24 h bei 4 °C zu kryoprotectieren. Dann Gewebe in eine 30%ige Saccharose-PBS-Lösung für weitere 24 h bei 4 °C vor dem Schnitt übertragen.
HINWEIS: Hirngewebe versinkt in Saccharose, wenn es für Mikrotome-Sektionen bereit ist. Hirngewebe kann langfristig in 30% Saccharose gespeichert werden. - Schnitt Hirngewebe koronal in 40 'm Abschnitte mit einem Mikrotom. Sammeln Sie Abschnitte, die am Anfang des Dentate Gyrus beginnen, etwa -1,20 mm von Bregma, und enden, nachdem die Platte vollständig ist, wobei der erste Abschnitt der vordere und der letzte Abschnitt der hintere ist. Konsultieren Sie einen Maus-Gehirnatlas, um die DG-Funktion genau zu identifizieren und Gewebesammlungskoordinaten zu starten.
- Bewahren Sie jeden Abschnitt seriell in Reihen von 6 in einer 48-Well-Platte auf, die mit Frostschutzlösung gefüllt ist (Tabelle 1).
| Frostschutzlösung | Ethylen-Glykol 150 ml + Saccharose 150 g + Füllung auf 500 ml 0,1 M PB für 500 ml Lösung |
| Citratpuffer | 9 ml Zitronensäurebestand + 41 ml Trinatriumcitratpuffer + 450 ml ddH2O |
| Zitronensäurebestand | [0,1 M] Zitronensäure 21 g/1 L ddH2O |
| Trinatriumcitratlager | [0,1 M] Trinatriumcitrat 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris Gepufferte Saline -Triton (TBS -Triton) | 0,05% 100-x Triton in TBS |
| Permeabilisierungspuffer | 0,5% 100-x Triton in TBS |
| Blocking Buffer | 0,33 ml Eselserum in 10 ml TBS-Triton |
| Edu Reaktionslösung | Machen Sieeine CuSO 4-5H2O-Lösung, indem Sie 1 mg CuSO45H2O in 4 ml Lösung [0,1 M] Tris pH 8.5 hinzufügen. Dann 1:40 einer 600-M-Alexa488-Azid-Lösung und 10 mg/ml L-Na+ Ascorbat in die CuSO 4-5H2-O-Lösung geben, bevor sie auf Gewebe aufträgt. |
Tabelle 1: Lösungen für die Immunhistochemie.
5. Immunhistochemie
- Grundlegendes floating Protokoll
HINWEIS: Wenn Nestin gefärbt wird, überspringen Sie Abschnitt 5.1, und fahren Sie mit Abschnitt 5.2 fort. Das grundlegende schwimmende Protokoll ist für Tbr2 oder Doublecortin (DCX) nur ohne Thymidin analoge Edu Färbung.- Übertragen Sie Abschnitte von der Frostschutzlösung in serieller Reihenfolge in einer 48-Well-Platte auf Tris-gepufferte Kochsaline (TBS).
- Waschen Sie Abschnitte zweimal in TBS-Triton (0,05% TBS-Triton, Tabelle 1) für 5 min, indem Sie die Lösung jedes Mal beim Schütteln oder auf einer Wippe bei langsamen Geschwindigkeiten ansaugen.
- Permeabilisieren Sie Abschnitte mit Permeabilisierungspuffer (0,5% TBS-Triton, Tabelle 1) für 20 bis 30 min beim Schütteln bei langsamen Geschwindigkeiten.
- Erstellen Sie den Sperrpuffer, indem Sie dem 10 ml TBS-Triton 0,33 l Eselserum hinzufügen. Frisch machen und innerhalb von 3 Tagen verwenden.
- Aspiratpermeabilisationspuffer und Inkubationsabschnitte im Sperrpuffer für 30 min bis 1 h bei Raumtemperatur (RT).
- Erstellen Sie die primäre Antikörperlösung im Blockierpuffer und fügen Sie sie zu jedem Brunnen hinzu. 500 l/well reicht aus, um alle Gewebeabschnitte vollständig unter Wasser zu setzen. Über Nacht bei RT auf einem Rocker oder Shaker bebrüten.
- Aspiratlösung und Spülabschnitte in TBS-Triton 3x für jeweils 10 min, um Spuren von Primärantikörpern zu entfernen.
- Inkubieren in Fluorophor konjugierten sekundären Antikörper gegen primäre Antikörper in Blockierpufferlösung für 2 h bei RT auf einer Wippe hergestellt.
- Waschen Sie Abschnitte 3x für je 5 min in TBS-Triton und inkubieren Sie dann Abschnitte in 4-,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Lösung (300 'M Lösung bei 1:100) in PBS für 15 min verdünnt.
- Waschen Sie Abschnitte 3x in PBS und montieren Sie Abschnitte, die die serielle Ordnung von vorn vorn bis hinter auf einer positiv geladenen Rutsche beibehalten. Gewebe bei RT trocknen lassen, bis die Feuchtigkeit sichtbar weg ist, in der Regel ca. 2 x 5 min, bevor sie mit Montagemedien abgedeckt wird.
- Antigen-Retrieval
HINWEIS: Dieser Abschnitt ist nur für nestin erforderlich. Wenn Nestin gefärbt wird, führen Sie diesen Abschnitt vor der analogen Färbung des Thymidins durch (Abschnitt 5.3). Überspringen für Tbr2 oder DCX Färbung mit Edu.- Platzieren Sie Gewebeabschnitte in PBS und montieren Sie 5-8 Abschnitte auf einem positiv geladenen Dia, das die serielle Ordnung von vorder nach hinten aufrechterhält. Lassen Sie Gewebeabschnitte bei RT trocknen, um vollständig an Dias haften zu lassen, was ca. 2 x 5 min dauert. Gewebe sollte sichtbar ohne Feuchtigkeit sein.
- Bereiten Sie den Citratpuffer (Tabelle 1) in einem Behälter vor, in der Regel eine Pipette-Spitzenbox von 1.000 l.
- Citratpuffer in einer Mikrowelle (1.000 W) 5 min erhitzen, bis die Lösung kocht. Während die Lösung die Heizung ist, legen Sie montierte Abschnitte in einen 20-Schiebe-Glasschieberhalter. Nach 5 min den Schiebehalter mit Abschnitten vorsichtig in die Pipettenbox legen.
- Stellen Sie die Mikrowellenleistung auf 50% und Kochen Zeit für 7 min. Starten Sie einen Timer für 7 min und beobachten Sie die Mikrowelle. Während dieser 7 Minuten, stoppen Sie die Mikrowelle, wenn die Lösung zu kochen beginnt und setzen Sie die Mikrowelle nach dem Kochen stoppt.
HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, die Wassertemperatur direkt unter der Siedetemperatur für 7 min zu halten. Stoppen Sie, nachdem der Timer ausläuft, auch wenn die Kochzeit auf der Mikrowelle noch nicht abgelaufen ist. Ausführlichere Anweisungen finden Sie in Hussaini et al.20. - Nehmen Sie die warme Box mit Citratpuffer und Geweberutschen heraus und legen Sie sie in einen Eiskübel, um sie abzukühlen. Abdeckung, um zu verhindern, dass Eis oder andere Materialien in die Lösung gelangen. Warten Sie ca. 30 min oder bis die Lösung kühl zum Anfassen ist.
- Fahren Sie mit Thymidin analogfärbung Schritt 5.3.2, wenn mit dem Thymidin Analog.
- Thymidin analoge Färbung
HINWEIS: Beginnen Sie hier, wenn Edu und Tbr2 oder Edu und DCX färben.- Platzieren Sie Gewebeabschnitte in PBS und montieren Sie 5-8 Abschnitte auf einem positiv geladenen Dia, das die serielle Ordnung von der vorderen zur hinteren und die gleiche Ausrichtung aufrechterhält. Lassen Sie Gewebeabschnitte trocknen, um vollständig an Dias haften und ziehen Sie dann einen Rahmen mit einem hydrophoben Stift oder PAP-Stift.
- Permeabilisieren Sie Abschnitte mit Permeabilisationspuffer (0,5% TBS-Triton) für 20 bis 30 min. Dann waschen Abschnitte 2x mit TBS-Triton für 5 min jeder.
HINWEIS: Die Permeabilisierung unterstützt die intrazelluläre Antikörperdurchdringung. Die Permeabilisationszeit kann je nach Gewebedicke und Antikörpereffizienz angepasst werden. Alternativ kann man die Waschmittelkonzentration erhöhen, um die Permeabilisationspotenz zu erhöhen. Jedoch, Vorsicht sollte darauf geachtet werden, nicht zu lange zu permeabilisieren, da Gewebe Fragilität mit längerer Permeabilisierungszeit zunimmt. - Edu-Reaktionslösung gemäß Tabelle 1vorbereiten. Die Endkonzentration von Alexa488-Azid beträgt 15 m in 1 ml Edu-Reaktionslösung.
- Inkubieren Sie Abschnitte in Edu Reaktionslösung für 30 min bis 1 h und waschen Sie dann 3x in TBS-Triton für jeweils 5 min. Abdeckung Schlitten in Aluminiumfolie, um vor Licht nach diesem Schritt zu schützen. Prüfen Sie in dieser Phase, ob die Edu-Reaktion mit einem Fluoreszenzmikroskop funktioniert. Edu-markierte Zellen fluoreszieren unter einem Epifluoreszenzmikroskop.
- Protokoll für montierte Gewebeabschnitte
- Blockgewebeabschnitte, die auf einer Folie von Schritt 5.3.4 mit Blockierpuffer montiert sind, der bei denselben Tieren wie der sekundäre Antikörper, z. B. Eselsserum, für 30 min bis 1 h angehoben wird, und dann 2x im TBS-Triton für jeweils 5 min waschen.
- Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung (d. h. Huhn Antinestin) während des Blockierungsschritts vor, indem Sie primäre Antikörper in einer blockierenden Pufferlösung bei 1:200 mischen. 250 l pro Schlitten sind ausreichend, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig in die Lösung eingetaucht ist.
- Inkubieren Sie Gewebeabschnitte in einer primären Antikörperlösung über Nacht bei RT nach blockenden Wähen. Ändern Sie diesen Schritt in Abhängigkeit vom verwendeten primären Antikörper.
HINWEIS: Wenn Antikörper einen hohen Hintergrund oder eine unspezifische Bindung haben, kann die Inkubation bei 4 °C anstelle von RT die Ergebnisse verbessern. Antikörper mit schlechter Gewebedurchdringung können bei Bedarf für 2 Tage inkubieren. - Inkubieren Sie Gewebeabschnitte 3x in TBS-Triton für 5 min, um überschüssigen primärantikörper zu entfernen. Dann inkubieren Gewebeabschnitte in Fluorophor konjugierten sekundären Antikörpern (d.h. Alexa 647 Anti-Huhn bei 1:200) in Blockierpufferlösung für 2 h bei RT vorbereitet.
- Inkubieren Sie Gewebeabschnitte 3x in TBS-Triton für 5 min, um überschüssigesekundäre Antikörper zu entfernen und 300 M DAPI-Lösung bei 1:100 in PBS für 15 min bei RT auftragen.
- Inkubieren Sie Gewebeabschnitte 3x in PBS für 5 min, um überschüssige DAPI zu entfernen und den Pap-Stift-Kreis aus dem Gewebe mit einem Wattestäbchen oder einem empfindlichen Aufgabenwisch zu entfernen. Lassen Sie die Abschnitte trocknen und tragen Sie dann Montagemedien und Deckelschlupf auf. Lassen Sie die Montage von Medien trocknen, bevor Sie Dias bebildern.
6. Bildsammlung
- Blinde Versuchsgruppen aus Kontrollgruppen, indem sie Diaetiketten abdecken und die gleiche Seite der DG mit einem konfokalen Mikroskop (Materialtabelle) mit einer 40-fachen ölvergrößerungoptischen Linse bei einer Schrittgröße von 1 m oder einem 20x 2x Zoom bei 1 m betrachten.
HINWEIS: Die 40-fache Ölvergrößerung wird eine höhere Auflösung bieten, dauert aber länger als der 20x 2x Zoom. - Legen Sie die Objektivlinse auf das 40-fache fest und klicken Sie dann auf die Registerkarte "Suchen" in der oberen linken Ecke in der konfokalen Software (Materialtabelle) und stellen Sie den gewünschten DG-Abschnitt in der Mitte des Sichtfeldes ein.
- Suchen Sie DG, wechseln Sie zur Registerkarte "Erfassung" in der oberen linken Ecke, und aktivieren Sie die folgenden Kontrollkästchen: Z-stack, tile-scanund position.
- Legen Sie Kanaleinstellungen zwischen 600 bis 750 Verstärkung, 1 % 15 % Laserintensität und 1-10-Offset fest. Überschreiten Sie die Laserintensität von 20 % für einen der Kanäle nicht. Stellen Sie sicher, dass keine Pixel übersättigt sind, wenn Sie Verstärkung und Intensität festlegen.
HINWEIS: Diese Bereiche variieren je nach Effizienz der eingesetzten Ausrüstung und Färbeeffizienz. - Legen Sie die Kacheln im Kachelscanfenster auf 7 horizontal und 3 vertikal fest, und drücken Sie das Scan-Übersichtsbild mit den gleichen Einstellungen wie die derzeit verwendeten. Verwenden Sie beispielsweise 7 horizontal e.B. 3 vertikal und das 20-fache Objektiv mit 2x Zoom.
- Stellen Sie sicher, dass sich die GD nach dem Übersichtsscan vollständig innerhalb des erwarteten Bildes befindet. Wenn nicht, passen Sie die Ansicht der GD so lange an, bis sie vollständig im Übersichtsbild enthalten ist, da es sich um ein repräsentatives Bild handelt, das man erhalten wird.
- Legen Sie die Bildtiefe fest, indem Sie mit dem Feinfokusknopf durch verschiedene Z-Stacks scrollen. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte GD innerhalb des Anfangs- und Endpunktes befindet. Geht man von einer Schrittgröße von 1 m aus, sollte jedes Bild etwa 40 Schritte betragen.
- Stellen Sie die Scangeschwindigkeit mit bidirektionalem Scannen und ohne Mittelung im Erfassungsmodusfenster auf 9 ein. Fügen Sie dann die Position im Positionsfenster hinzu.
HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 6.3 x 6.8, um mehrere DGs gleichzeitig abzubilden. Durch die Erhöhung der Scangeschwindigkeit wird die Bildqualität verringert, aber die Gesamtbildzeit verringert. Wenn die Bildqualität zu niedrig ist, reduzieren Sie die Scangeschwindigkeit oder erhöhen Sie die Mittelung. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten, wenn Sie bereit sind. Scannen Sie 5 Abschnitte von DG pro Maus entlang der vorderen zur hinteren Achse. Wenn z. B. die linke DG für Abschnitt 1 abgebildet ist, stellen Sie die nächstdhintere linke DG für Abschnitt 2 vor.
- Heften Sie separate Bilder zusammen, um ein vollständiges Bild des Dentat-Gyrus mit der Stichfunktion unter der Prozess-Registerkarte in der konfokalen Software zu bilden. Alternativ können Sie mit FIJI (ImageJ) Bilder zu einem vollständigen Dentate-Gyrus zusammenfügen.
- Speichern Sie genähte Bilder zur Quantifizierung.
7. Bildanalyse
- Öffnen Sie jedes Bild jedes Dentat-Gyrus-Abschnitts mit FIJI als maximale Projektion und als zusammengesetztes Bild mit den Kanälen, die in unterschiedlichen Farben zusammengeführt werden, um die Kolokalisierung einfach zu visualisieren.
- Messen Sie die Fläche der GD für jeden Abschnitt des maximalen Projektionsbildes mit dem Polygonauswahlwerkzeug (drittes Feld von links) und zeichnen Sie für jeden Abschnitt jeder Maus auf. Dies wird der Bereich der GD sein, der zur Berechnung der Dichte verwendet wird.
- Zeichnen Sie die Anzahl der Zellen in DG aus dem zusammengesetzten Bild auf, die einen kolokalisierenden primären Antikörper (d. h. Nestin) und das Thymidin-Analoge Edu haben, indem Sie den FIJI-Plugin-Zellzähler unter Plugins verwenden | analysieren | Zellzähler | Zellenzähler. Zeichnen Sie außerdem die Gesamtzahl der Edu-positiven und nestin-positiven Zellen mit einem radialen Prozess auf.
HINWEIS: Im Falle von Nestin ist es sehr wichtig, auf die Morphologie zu achten. Bei der Quantifizierung neuronaler Stammzellen stellen Sie sicher, dass nur Zellen mit einem radialen Prozess quantifiziert werden. Wenden Sie bei der Quantifizierung von Dentat-Gyrus-Abschnitten die gleichen Kriterien auf alle an, insbesondere bei der Visualisierung von Zellen außerhalb einer Brennebene. Wenn sich Zellen nicht innerhalb der Brennebene befinden, zählen Sie sie nicht. Ausführlichere Anweisungen zur stereologischen Quantifizierung finden Sie unter West et al.21. - Geben Sie die Zellenanzahl in eine Tabellenkalkulationssoftware ein, um alle Daten für die spätere Analyse zu kompilieren.
- Berechnen Sie die Dichte der kolokalisierten Zellen für jeden Abschnitt, indem Sie die Gesamtzahl der kolokalisierten Zellen durch das Gesamtvolumen für jeden Abschnitt in jedem Tier dividieren. Erhalten Sie beispielsweise die Stammzelldichte, indem Sie die Summe der nestin+/edu+-Zellen in einem Tier durch die Summe des DG-Volumens in einem Tier dividieren. Berechnen Sie das Volumen jedes Abschnitts, indem Sie die Fläche mit den gesamten Z-Schritten multiplizieren, wobei davon ausgegangen wird, dass jeder Schritt 1 m beträgt.
HINWEIS: In diesem Protokoll sollten die Gesamtschritte nahe 40 sein, da Gewebe auf 40 m geschnitten wird. Stellen Sie sicher, dass jedes Tier ein Datenpunkt ist, da das Ziel dieses Ansatzes darin besteht, die Gesamtmenge der kolokalisierten Zellen in einer Hemisphäre eines Hippocampus zu schätzen. - Führen Sie zusätzliche notwendige Berechnungen für die Frage aus, die man zu beantworten versucht. In diesem Beispiel berechnen Sie die Gesamtzahl der proliferierenden Zellen, die gesamte Stammzellpopulation und Prozent der proliferierenden Stammzellen nach der Stimulierung kontralateraler Mooszellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach den oben beschriebenen experimentellen Verfahren (Abbildung 1A,B) konnten wir die Auswirkungen der Stimulierung kontralateraler Mooszellprojektionen auf die neurogene Nische innerhalb des Hippocampus bestimmen. Durch die Verwendung eines cre-abhängigen Gq-gekoppelten stimulierenden DREADD-Virus gepaart mit einer moosigen Zelle mit der Bezeichnung 5-HT2A Cre-line konnten wir selektiv exzitatorische Projektionen von moosigen Zellen auf die kontralaterale DG aktivieren und festgestellt, dass starke Mooszellen Stimulation geförderte Stammzellruhe (Abbildung 1C). Wir haben die genaue Virusabgabe vor der Analyse des Gewebes überprüft (Abbildung 2A,B). Zusätzlich haben wir die Aktivierung von Mooszellen durch c-fos Immunhistochemie-Experimente überprüft (Daten nicht gezeigt). Im Falle einer unsachgemäßen Virusinjektion, schließen Sie Tier von weiteren Analysen aus. Eine unsachgemäße Injektion ist eine, die nicht auf die gewünschten Koordinaten zielt, den größten Teil des Ausdrucks außerhalb der gewünschten Region hat oder wenig bis gar keine virale Lieferung hat. Für dieses Experiment waren moosige Zellen im Hilus der GD das beabsichtigte Ziel, und wenn Injektionen außerhalb des Hilus waren, wurden sie ausgeschlossen. Durch die Verwendung eines Thymidin-Analog-, Edu- und Antigen-Retrievals für die Nestin-Färbung, die in den Abschnitten 5.2 und 5.3 beschrieben ist, konnten wir vermehrende neuronale Stammzellen erfolgreich kennzeichnen (Abbildung 3A). Zusätzlich konnten wir durch Weglassen des Antigen-Retrieval-Schritts, Abschnitt 5.2, Tbr2-positive neuronale Vorläufer und Neuroblasten sowie DCX-positive Neuroblasten und unreife Neuronen beschriften (Abbildung 3A). Wir zeigen ein Beispiel für die Quantifizierung und Berechnung der Dichte und ein Beispiel für montiertes Gewebe auf einem Dia (Abbildung3B und Abbildung 4A). Darüber hinaus werden sowohl erfolgreiche als auch subparische Experimente als Referenzen für experimentelle Ansätze bereitgestellt (Abbildung 4B). Schließlich gibt es mehrere verschiedene Quantifizierungen, die aus einem erfolgreichen Experiment gewonnen werden können (Abbildung 5A-D)15. Die Quantifizierungen umfassen die Dichte der wuchernden neuronalen Stammzellen (Nestin+/Edu+/Volumen), den Prozentsatz der wuchernden neuronalen Stammzellen (Nestin+/Edu+/total nestin), die gesamtwuchernden Zellen (Edu+/Volumen) und den gesamten Stammzellpool (Nestin+/Volumen) ). Bei der kontralateralen Stimulation einer moosigen Zelle wurde eine Abnahme der proliferation neuronaler Stammzellen beobachtet. Ähnliche Quantifizierungen können für neuronale Vorläufer und unreife Neuronen mit dem entsprechenden Antikörper erhalten werden.
Abbildung 1: Experimenteller Ansatz zur Assay-Schaltungsregulation adulter neuronaler Stammzellen. (A) Schematisch, der die verschiedenen im Protokoll beschriebenen Schritte darstellt. (B) Zeitleiste des experimentellen Ansatzes zur Stimulierung moosiger Zellen bei Nagetieren. (C) Injektionsschema, das auf kontralaterale Mooszellen zur Stimulation abzielt. (D) Schemat der Entwicklungslinie adulter neuronaler Stammzellen in der subgranularen Zone (SGZ), der Granulatzellschicht (GCL) und der molekularen Schicht (ML) mit entsprechenden Antikörpern, die in verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet werden. Die verschiedenen Entwicklungsstadien umfassen entweder ruhecente oder aktivierte radiale neuronale Stammzellen (NSC), neuronale Vorläufer (NP), Neuroblast (NB), unreife Granulatzellen (GC) und reife GC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Nachweis einer effektiven Virusabgabe. (A) Immunfluoreszenzbilder einer genauen Virusabgabe. Virale Partikel exprimieren ein mCherry fluoreszierendes Etikett, das moosige Zellen im Hilus (weiß geschachtelter Bereich) anvisiert. DAPI kennzeichnet Zellkerne. Die Bildseite der genauen viralen Lieferung zeigt klare moosige Faserprojektionen von der kontralateralen Injektionsseite. (B) Immunfluoreszenzbilder von Virusinjektionen außerhalb des Ziels. Beachten Sie, dass in diesem Fall kontralaterale Moosfasern in der Bildseite fehlen. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Analyse von sich ausbreitenden neuronalen Stammzellen und Nachkommen. (A) Immunhistochemie-Bilder von Thymidin-AnalogE kolokalisieren mit spezifischen Zellstadiummarkern Nestin (neurale Stammzellen und Vorläufer), Tbr2 (neurale Stammzellen, neuronale Vorläufer) und DCX (Neuroblast, unreife Neuronen) weißen Pfeilspitzen. Skala bar = 10 m. (B) Repräsentative Messung der Fläche innerhalb des Dentat-Gyrus, der zur Berechnung der Dichte verwendet wird. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Nachweis der Immunfluoreszenzpräparation. (A) Schemat, das die stereologische Trennung der montierten Gewebeabschnitte von der vorderen zur hinteren Achse demonstriert. Rotes Kästchen bezeichnet die abgebildete Seite. (B) Nachweis erfolgreicher und subparimmunoeszenzischer Experimente für neuronale Abstammungsmarker. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die kontralaterale Aktivierung moosiger Zellen verringert die Proliferation neuronaler Stammzellen. (A) Immunhistochemie-Quantifizierungen von Nestin+/Edu+-Zellen im Dentate-Gyrus zeigen eine Abnahme der Proliferation nach Stimulation kontralateraler Mooszellen. (B) Abnahme des Prozentsatzes der sich vermehrenden neuronalen Stammzellen in der Gruppe mit aktivierten kontralateralen Mooszellen. (C) In beiden Gruppen gab es keine signifikante Veränderung der neuronalen Stammzelldichte. (D) Es gab keine Veränderung der Gesamtkonzentrationen der proliferierenden Zellen im Dentate-Gyrus. Die Werte stehen für den Mittelwert des Standardfehlers der Messung. p < 0,05 (n = 3 für Steuerung, n = 5 für die hM3D-Gruppe). Diese Figur wurde von Yeh et al.15adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Ziel dieses Protokolls ist es zu beurteilen, wie die Manipulation bestimmter neuronaler Schaltkreise die adulte Hippocampus-Neurogenese in vivo mit einer Reihe von Immunhistochemie-Techniken reguliert. Die aktivitätsabhängige Regulation der adulten Neurogenese, die durch bestimmte neuronale Schaltkreise vermittelt wird, ist eine wertvolle Technik mit großem Potenzial für Modifikationen, um eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen. Der Erfolg dieser Arten von Experimenten hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der genauen Viralabgabe, der richtigen Viralauswahl für die gewünschte Manipulation, der ordnungsgemäßen Abgabe eines Thymidin-Analogs, des tierischen Alters, der Immunfärbungseffizienz, des Erfolgreichen transkardiale Perfusionen und unvoreingenommene Quantifizierung von Bildern. Beispielsweise kann eine ungenaue Virusabgabe Zieleffekte verursachen, die zu einem Phänotyp führen, der nichts mit dem betreffenden Schaltkreis zu tun hat. Darüber hinaus können minderwertige Immunfluoreszenztechniken die wahre Anzahl der vorhandenen Zellen verbergen und daher einen Phänotyp produzieren, der biologisch nicht relevant ist. Ein weiterer sehr wichtiger Faktor zu kontrollieren ist das Alter der Mäuse bei der Durchführung von Experimenten, wenn man bedenkt, dass erwachsene Neurogenese altersabhängigist 22. Schließlich ist es wichtig, dass jeder Abschnitt unvoreingenommen bewertet wird. Um Verzerrungen zu reduzieren, gehen Sie einen methodischen Ansatz und stellen Sie sicher, dass die Person Scoring ist kompetent bei der Identifizierung der Stadien der Erwachsenen NSC Entwicklung mit morphologischen Informationen. Darüber hinaus blinden sowohl Kontroll- als auch Behandlungsgruppen und offenbaren ihre Identitäten nach Bildquantifizierungen. Als zusätzliche Maßnahme zur Verringerung der Verzerrung können zwei separate Personen denselben Datensatz quantifizieren, um die beobachteten Ergebnisse zu validieren.
Es gibt mehrere Einschränkungen im Zusammenhang mit diesem Ansatz zur Untersuchung Schaltung Aktivität abhängige Regulierung von Erwachsenen NSCs und Neugeborenen Nachkommen. Die erste Einschränkung besteht darin, dass dieser Ansatz keine Informationen über die spezifischen Zelltypen innerhalb einer Schaltung liefert, die den Gesamteffekt auf NSCs durch die Manipulation der betreffenden Schaltung vermitteln. Dies bedeutet, dass, obwohl es eine phänotypische Wirkung auf erwachsene NSCs geben könnte, der Effekt durch einen oder mehrere Zwischenzelltypen wirken kann. Eine effiziente Möglichkeit, dieses Problem anzugehen, besteht darin, diese Studien mit der Elektrophysiologie zu koppeln, um die Vermittler festzuhalten. Eine zusätzliche Einschränkung dieses Protokolls ist die Notwendigkeit, entweder eine bestimmte Cre-Maus (5-HTR2A) Linie oder ein virales Konstrukt (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) zu haben, das auf die gewünschte Schaltung abzielen kann. Wenn eine effektive zellspezifische Cre-Mauslinie für eine Interessenfrage nicht ohne weiteres verfügbar ist, wird die Fähigkeit, diese Schaltung zu studieren, immer schwieriger. Jedoch, viele Zelltypen im Gehirn haben Cre spezifische Mauslinien. Eine geringere Einschränkung dieses Protokolls bezieht sich auf CNO als effektive inertLigand. Kürzlich, Studien gezeigt, dass CNO, die inerte Chemikalie verwendet, um DREADDs zu aktivieren, metabolisiert Clozapin, die Verhaltensphänotypen verursachen kann23. Eine effiziente Lösung besteht jedoch darin, in jedem Experiment ordnungsgemäße Kontrollen einzubeziehen. Ein Beispiel für die richtige Kontrolle umfasst sowohl eine CNO- als auch eine DREADD-Steuerung, bei der CNO in Kombination mit einem Kontrollreportervirus (AAV5-DIO-mCherry) verabreicht wird, und eine saline-Kontrolle, bei der keine CNO-Gruppe an eine Reportervirusgruppe verabreicht wird. Durch die Einbeziehung dieser Steuerelemente können die Auswirkungen nur von CNO isoliert werden. Alternativ, eine sekundäre inert Ligand bekannt als C21, wurde vor kurzem gezeigt, dass eine ähnliche Wirksamkeit und Wirksamkeit ohne nachgewiesene Verhaltenseffekte24. Schließlich ist eine endgültige Einschränkung dieses Protokolls die Kontrolle der CNO-Menge, die jedes Tier während des Experiments verbraucht. Verschiedene Tiere trinken CNO-haltiges Wasser in unterschiedlichem Ausmaß und können daher eine Reihe von Auswirkungen auf die adulte Neurogenese haben. Im Allgemeinen neigt eine Maus dazu, etwa 4 ml CNO-Wasser in einem Zeitraum von 24 h zu trinken. Dies bedeutet, dass Bei einer Konzentration von 1 mg/200 ml erhalten Tiere insgesamt 0,02 mg CNO pro Tag, was mit der Menge einer einzigen CNO-Dosis vergleichbar ist, die intraperitoneal injiziert wird. Wenn eine rechtzeitiggekoppelte Verabreichung von CNO ein Problem darstellt, kann die Umstellung auf intraperitoneale Injektionen eine bessere Alternative sein.
Der Vorteil dieses Protokolls ist der Grad der Spezifität, der bei der Modulation der adulten Neurogenese erreicht wird. Frühere Neurogenese-Studien haben systemisch verabreichten pharmakologischen Agonisten oder Antagonisten genutzt, um Schaltkreiskomponenten zu modulieren. Diese unspezifischen Manipulationen können phänotypische Unterschiede erzeugen, bieten aber wenig Einblick in Mechanismen, die an der Reglementität adulter neuronaler Stammzellen beteiligt sind. Zusätzlich kann dieses Protokoll leicht geändert werden, um verschiedene schaltungsweite Auswirkungen auf die adulte Neurogenese zu untersuchen. Zum Beispiel, indem man zu einem hemmenden DREADD wechselt, oder indem man eine oder mehrere Gehirnregionen gleichzeitig anvisiert, kann man eine Reihe von Fragen stellen, um die schaltungsspezifische Regulation der adulten Neurogenese zu verstehen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung dieses Protokolls gegenüber früheren Ansätzen ist, dass die Verwendung eines Nestin-Antikörpers die transgene Tierzucht von fluoreszierend codierten neuronalen Stammzellreportern wie nestin:GFP eliminiert, die Effizienz erhöht und die Zeit pro Experiment8. Darüber hinaus begrenzt diese Technik die Handhabung von Nagetieren bei der Verabreichung von CNO, wodurch Nagetierbelastungen während der Experimente reduziert werden. Es ist wichtig, Stress beim Studium stressempfindlicher Prozesse zu reduzieren. Schließlich kann dieser Ansatz leicht geändert werden, um einen Verhaltenstest einzubeziehen, zum Beispiel, wenn man sich dafür interessieren würde, ob der kontralaterale Mooszellkreis, der NSCs moduliert, auch beim räumlichen Lernen oder bei der Stressresilienz eine Rolle spielt.
Die wichtigste technische Schwierigkeit bei der Verwendung dieses Ansatzes ist die genaue Virallieferung. Ein kompetenter Nagetierchirurg zu werden, übt sich in der Praxis und kann eine erhebliche Fehlerbehebung durchführen. Es ist daher ratsam, eine Reihe von Pilotversuchen durchzuführen, um viralen Titer, Etikettierungseffizienz und virale Ausbreitung zu testen. Wir haben festgestellt, dass bestimmte Serotypen unterschiedliche Ausbreitungsmuster haben und dass sich der AAV2-Serotyp weniger ausbreitet als AAV5 oder AAV8. Darüber hinaus ist es am besten, einen vertrauenswürdigen Anbieter von viralen Verpackungen für jedes dieser Experimente zu haben. Durch die Durchführung von Pilotoperationen können viele dieser Bedenken angegangen werden und man kann Zeit sparen. Es wird auch empfohlen, verschiedene CNO-Konzentrationen zu testen, um die gewünschten Schaltkreise zu stimulieren oder zu hemmen. Im Allgemeinen werden 1 mg/kg getestete Schaltkreise ausreichend aktivieren, aber bestimmte Zelltypen können mehr oder weniger CNO erfordern. Es ist wichtig zu beachten, dass die Dosis der CNO-Verabreichung bestimmte Schaltkreise differenziell beeinflussen kann, insbesondere wenn man etwas wie Mooszellen15betrachtet.
Alternative Anwendungen dieses Protokolls umfassen simultane Verhaltenstests, Modulation alternativer Schaltkreise und zusätzliche Analyse von Neurogenese-Funktionen. Um Verhaltenstests durchzuführen, könnte man dem beschriebenen Protokoll folgen und nach der Verwaltung von CNO eine bestimmte Verhaltensaufgabe ausführen, z. B. einen neuartigen Standorttest oder eine räumliche Navigationsaufgabe. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass ein einzelnes Experiment sowohl verhaltens- als auch kreisspezifische Informationen liefern würde, die zu einem schaltungsspezifischen Verhaltensphänotyp führen könnten. Um alternative Schaltungen zu modulieren, kann man eine Kombination aus verschiedenen Cre-Linien und viralen Vektoren verwenden. Wenn man zum Beispiel daran interessiert wäre zu verstehen, wie die Hemmung dopaminergen Neuronen aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) oder VTA die adulte Neurogenese moduliert, könnte man eine Tyrosinhydroxylase Cre-Mauslinie verwenden und eine creabhängige hM4D (hemmend) injizieren. DREADD-Virus in die VTA, um dopaminerge spezifische Regulation der adulten Neurogenese zu bestimmen. Die Möglichkeiten, alternative Hirnregionen mit diesem Ansatz ins Visier zu nehmen, sind riesig und können strategisch genutzt werden, um zwingende neuronale Schaltkreise abzuhören. Schließlich ermöglicht dieser Ansatz, zusätzliche Stadien der adulten Neurogenese zu untersuchen. Wenn man zum Beispiel verstehen wollte, wie stimulierende Mooszellen die Arborisierung oder die dendritische Länge unreifer Neuronen beeinflussen, würde man einem ähnlichen Protokoll folgen, aber alternative Analysen wie die Shollanalyse durchführen.
Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen detaillierten Schritt-für-Schritt-Prozess, um die schaltungsaktivitätabhängige Regulierung von nSCs und Neurogenese bei Erwachsenen über die DREADD-Technologie zu untersuchen. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, leicht geändert werden, um eine Breite von Fragen in Bezug auf schaltungspezifische adulte neuronale Stammzellregulation zu adressieren. Mit der Weiterentwicklung der clusterierten, regelmäßig interspaceierten Kurz-Palindrom-Repeats-Technologie (CRISPR) ist es nun einfacher, zellspezifische Cre-Mauslinien zu generieren, um sich mit anspruchsvollen viralen Konstrukten zu paaren, um immer komplexere Fragen zu beantworten. Erweiterung der Anwendbarkeit dieses Protokolls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
L.J.Q. wurde vom National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter Diversity Supplement R01MH111773 sowie einem T32-Ausbildungsstipendium T32NS007431-20 unterstützt. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse unterstützt, die J.S. von NIH (MH111773, AG058160 und NS104530) gewährt wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Roth, B. L.
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
