Summary

Groei en karakterisering van bestraalde Organoids van de borstklieren

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Organoids ontwikkeld van muis borstklieren werden bestraald en gekarakteriseerd om epitheel eigenschappen en interacties met immuun cellen te beoordelen. Bestraalde organoids kan worden gebruikt om cel-cel interacties beter te evalueren die tot de rekrutering van de tumor cel in bestraald normaal weefsel kunnen leiden.

Abstract

Organoids afgeleid van het verteerd weefsel zijn multicellulaire driedimensionale (3D) constructies die beter recapituleren in vivo omstandigheden dan cel monolayers. Hoewel ze niet volledig kunnen modelleren in vivo complexiteit, behouden ze een aantal functionaliteit van het oorspronkelijke orgel. In kanker modellen, organoids worden vaak gebruikt om tumor cel invasie studie. Dit protocol beoogt te ontwikkelen en te karakteriseren organoids van de normale en bestraalde muis borstklier weefsel om de straling reactie in normale weefsels te evalueren. Deze organoids kunnen op toekomstige in vitro kanker studies worden toegepast om de interactie van de tumor cel met bestraalde organoids te evalueren. De borstklieren werden ontleed, bestraald tot 20 GY en verteerd in een Collagenase VIII oplossing. De epitheel organoids werden gescheiden via centrifugaal differentiatie, en 3D organoids werden ontwikkeld in 96-goed laag-adhesie microplaten. Organoids drukte de kenmerkende epitheel teller cytokeratine 14 uit. Macrofagen interactie met de organoids werd waargenomen in co-cultuur experimenten. Dit model kan nuttig zijn voor het bestuderen van tumor-stromale interacties, infiltratie van immune cellen, en de polarisatie van de macrofagen binnen een bestraald micro-milieu.

Introduction

Ongeveer 60% van de drievoudige negatieve borstkanker (TNBC) patiënten kiezen voor borst-conserverende therapie (BCT) als een vorm van behandeling1. In deze behandeling modaliteit, de tumor die een deel van het borstweefsel wordt verwijderd, en de omliggende normale weefsel wordt blootgesteld aan ioniserende straling om eventuele resterende tumorcellen te doden. De behandeling vermindert herhaling in veel van de bevolking van borstkanker; echter, ongeveer 13,5% van de behandelde patiënten met TNBC ervaring locoregionale herhalingen2. Daarom, het bestuderen van hoe straling kan aanwerven circulerende tumorcellen (ctcs) zal leiden tot belangrijke inzichten in de lokale recidief3,4.

Het vorige werk heeft aangetoond dat de straling van het normale weefsel rekrutering van diverse cel types5verhoogt. In pre-klinische modellen van TNBC, bestraling van normaal weefsel toegenomen macrofagen en vervolgens tumor cel rekrutering tot normale weefsels5. De immune status beïnvloedde de rekrutering van de tumor cel aan bestraalde plaatsen, met de migratie van de tumor cel waargenomen in immuungecompromitteerde onderwerpen. Recapitulerend deze interacties met behulp van organoids afgeleid van de borstklieren zal de observatie van de cel migratie en cel-stromale interacties in real-time met microscopie en live cel beeldvorming om de rol van straling schade te bepalen in het veranderen tumor cel gedrag.

Muis borstklieren organoids hebben geholpen bij het ophelderen van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de borstklier. Een borst organite is een multicellulaire, driedimensionale constructie van geïsoleerde borst epitheel dat groter is dan 50 μm6,7,8,9,10. Met behulp van primaire epitheel organoids, Simian et al. geëvalueerd noodzakelijke factoren voor vertakking in de borstklier7. Shamir et al. ontdekte dat de verspreiding kan plaatsvinden zonder een epitheel om mesenchymale overgang, het verstrekken van inzicht in de gemetastaseerde Cascade8. Methoden voor het genereren en karakteriseren organoids van de borstklier weefsel zijn goed ingeburgerd6,11,12,13. Nochtans, aan onze kennis, zijn de methodes om bestraalde organoids van borstklieren te kweken niet gemeld. Een protocol voor het kweken van en het kenmerken van bestraalde organoids zou een kritieke stap in Recapitulerend straling-veroorzaakte immune en de rekrutering van de tumor cel zijn.

In deze paper, rapporteren we een methode voor het kweken en karakteriseren bestraalde borstklier epitheel organoids in lage adhesie microplates bekleed met een hydrofiele polymeer dat de vorming van sferoïden ondersteunt. Deze organoids werden samen met macrofagen gekweekt om de kinetiek van infiltratie van de immune cel te onderzoeken. Dit werk kan worden uitgebreid tot co-kweken organoids met vetcellen te recapituleren borstklieren kenmerken, borstkanker cellen te visualiseren tumor cel aanwerving, en CD8 + T cellen te bestuderen tumor-immune cel interacties. Eerder vastgestelde protocollen kunnen worden gebruikt om bestraalde organoids te evalueren. Eerdere modellen co-kweken borstklieren organoids en immuun cellen hebben licht werpen op de mechanismen van metastase en verspreiding. Denardo et al. vond dat CD4 + T Cell regulering van tumorgeassocieerde macrofagen verbeterde een gemetastaseerde fenotype van de borst adenocarcinomen14. Er zijn ook cocultuur modellen gebruikt om mechanismen van biologische ontwikkeling te verhelderen. Plaks et al. verduidelijkte de rol van CD4 + T cellen als down-regulatoren van de borst organogenese15. Echter, onze groep is de eerste om een procedure van het visualiseren van hoe normaal weefsel straling invloeden immuun cel gedrag vast te stellen. Omdat normaal weefsel bestraling is aangetoond dat tumor cel rekrutering te verbeteren5, kan dit Protocol verder worden ontwikkeld om te analyseren hoe tumorcellen gedrag wordt gewijzigd door bestraling van normale weefsels en cellen, wat leidt tot een beter begrip van kanker recidief.

Protocol

Animal studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en protocollen goedgekeurd door de Vanderbilt University Institutional Animal Care en use Comite. 1. voorbereiding van muizen en cel aanwinst (aangepast van Nguyen-Ngoc et al.11) Offer athymic nu/nu muizen (8-10 weken oud) met behulp van CO2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Reinig de huid met behulp van 70% ethanol. Resekte abdominale en Lie…

Representative Results

Bestraalde epitheel borsten organoids werden met succes verkregen van de muis borstklieren, verwerkt, en gekweekt op lage-adhesie platen (Figuur 1). Organite opbrengst werd getest door zaaien in verschillende groei omgevingen (Figuur 2a-G). Zaaien cellen direct op weefselcultuur behandeld 10 cm cel platen leverde een overgroei van fibroblast cellen. Fibroblasten werden geïdentificeerd onder fasecontrast microscopie in of in de buurt van hetzelfde vlak van de focus als organ…

Discussion

In dit protocol hebben we een methode ontwikkeld voor reproduceerbare groei en karakterisering van bestraalde borst organoids (Figuur 1). Een stralingsdosis van 20 GY werd toegepast op de spiegel vorige in vivo modellen van de cel van de tumor rekrutering5. Bestraling van de borstklieren ex vivo voorafgaand aan organite vorming toegestaan voor isolatie van stralingsschade effecten zonder een overeenkomstige infiltratie van het immuunsysteem cellen. De ontwikkeling van…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Laura L. Bronsart voor het verstrekken van GFP en dTomato-gelabelde RAUWe 264,7 macrofagen. Dit onderzoek werd financieel gesteund door NIH Grant #R00CA201304.

Materials

10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

Riferimenti

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Ricerca sul cancro. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochimica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
  27. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  30. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  31. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  32. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
check_url/it/59293?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Hacker, B. C., Gomez, J. D., Batista, C. A. S., Rafat, M. Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands. J. Vis. Exp. (147), e59293, doi:10.3791/59293 (2019).

View Video