Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.
Los organoides derivados del tejido digerido son construcciones tridimensionales (3D) multicelulares que mejor recapitulan las condiciones in vivo que las monocapas celulares. Aunque no pueden modelar completamente la complejidad in vivo, conservan alguna funcionalidad del órgano original. En los modelos de cáncer, los organoides se utilizan comúnmente para estudiar la invasión de células tumorales. Este protocolo tiene como objetivo desarrollar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias de ratones irradiados y normales para evaluar la respuesta a la radiación en los tejidos normales. Estos organoides se pueden aplicar a futuros estudios de cáncer in vitro para evaluar las interacciones de células tumorales con organoides irradiados. Las glándulas mamarias fueron reeliminadas, irradiadas a 20 GY y digerida en una solución de colagenasa VIII. Los organoides epiteliales fueron separados a través de la diferenciación centrífuga, y los organoides 3D fueron desarrollados en microplacas de baja adherencia de 96-well. Los organoides expresaron el característico marcador epitelial citoqueratina 14. La interacción de los macrófagos con los organoides se observó en experimentos de co-cultivo. Este modelo puede ser útil para estudiar interacciones tumor-stromal, infiltración de células inmunitarias y polarización de macrófagos dentro de un microambiente irradiado.
Aproximadamente el 60% de los pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC) eligen la terapia de conservación de mamas (BCT) como forma de tratamiento1. En esta modalidad de tratamiento, se extrae el tumor que contiene parte del tejido mamario y el tejido normal circundante se expone a la radiación ionizante para eliminar las células tumorales residuales. El tratamiento reduce la recurrencia en gran parte de la población de cáncer de mama; sin embargo, aproximadamente el 13,5% de los pacientes tratados con TNBC experimentan recurrencias locoregionales2. Por lo tanto, estudiar cómo la radiación puede reclutar células tumorales circulantes (CTCS) dará lugar a información importante sobre la recurrencia local3,4.
El trabajo anterior ha demostrado que la radiación del tejido normal aumenta el reclutamiento de varios tipos de células5. En los modelos preclínicos de TNBC, la irradiación del tejido normal aumentó el macrófago y posteriormente el reclutamiento de células tumorales a los tejidos normales5. El estado inmune influyó en el reclutamiento de células tumorales en sitios irradiados, con migración de células tumorales observadas en sujetos inmunodeprimido. La recapitulación de estas interacciones utilizando organoides derivados de glándulas mamarias permitirá la observación de la migración celular y las interacciones celular-stromal en tiempo real con la microscopía y las imágenes de células vivas para determinar el papel del daño por radiación en la alteración comportamiento de las células tumorales.
Los organoides mamarios de ratones han ayudado a aclarar los pasos clave en el desarrollo de la glándula mamaria. Un organoide mamario es una construcción tridimensional multicelular de epitelio mamario aislado que es más grande que 50 μm6,7,8,9,10. Utilizando los organoides epiteliales primarios, Simian y otros evaluaron los factores necesarios para la ramificación en la glándula mamaria7. Shamir y otros descubrieron que la diseminación puede ocurrir sin un epitelio a la transición mesenquimal, proporcionando una visión de la cascada metastásica8. Los métodos para generar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias están bien establecidos6,11,12,13. Sin embargo, según nuestro conocimiento, no se han notificado métodos para cultivar organoides irradiados a partir de glándulas mamarias. Un protocolo para cultivar y caracterizar los organoides irradiados sería un paso crítico en la recapitulación del reclutamiento inmunológico inducido por radiación y de células tumorales.
En este documento, se informa de un método para cultivar y caracterizar los organoides epiteliales mamarios irradiados en microplacas de baja adherencia recubiertas con un polímero hidrófilo que apoya la formación de esferoides. Estos organoides fueron cocultivados con macrófagos para examinar la cinética de infiltración de células inmunitarias. Este trabajo se puede ampliar para incluir organoides de coculturación con células adiposas para recapitular características mamarias, células de cáncer de mama para visualizar el reclutamiento de células tumorales, y las células T CD8 + para estudiar las interacciones de células inmunes del tumor. Se pueden utilizar protocolos previamente establecidos para evaluar los organoides irradiados. Los modelos anteriores que coculturan los organoides mamarios y las células inmunitarias han arrojar luz sobre los mecanismos de metástasis y diseminación. DeNardo y otros descubrieron que la regulación de linfocitos T CD4 + de los macrófagos asociados al tumor mejoró un fenotipo metastásico de adenocarcinomas mamarios14. También se han utilizado modelos de cocultivo para dilucidar los mecanismos de desarrollo biológico. Plaks et al. aclaró el papel de las células T CD4 + como reguladores de la organogénesis mamaria15. Sin embargo, nuestro grupo es el primero en establecer un procedimiento para visualizar cómo la irradiación del tejido normal influye en el comportamiento de las células inmunes. Debido a que se ha demostrado que la irradiación del tejido normal mejora el reclutamiento de células tumorales5, este protocolo se puede desarrollar aún más para analizar cómo el comportamiento de las células tumorales se altera por la irradiación del tejido y las células normales, lo que conduce a una mayor comprensión de recurrencia del cáncer.
En este protocolo, hemos desarrollado un método para el crecimiento reproducible y la caracterización de los organoides mamarios irradiados (figura 1). Se aplicó una dosis de irradiación de 20 GY para reflejar los modelos anteriores in vivo de reclutamiento de células tumorales5. La irradiación de las glándulas mamarias ex vivo antes de la formación organoide permitió el aislamiento de los efectos de daño por radiación sin una infiltración correspondiente …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Dra. Laura L. Bronsart por proveer los macrófagos RAW 264,7 etiquetados con GFP y dTomato. Esta investigación fue apoyada financieramente por la beca NIH #R00CA201304.
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
Collagen Type I | Corning | 354236 | |
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
DNAse | Roche | 10104159001 | |
DPBS | Fisher | 14190250 | |
E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
FBS | Sigma | F0926 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
PBS | VWR | 10128-856 | |
Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |