Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.
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Articolo metodologico
Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi derivati dal tessuto digerito sono costrutti tridimensionali (3D) multicellulari che ricapitolano meglio le condizioni in vivo rispetto ai monostrati cellulari. Anche se non possono modellare completamente la complessità in vivo, mantengono alcune funzionalità dell'organo originale. Nei modelli tumorali, gli organoidi sono comunemente usati per studiare l'invasione delle cellule tumorali. Questo protocollo mira a sviluppare e caratterizzare gli organoidi dal normale e irradiato tessuto della ghiandola mammaria del topo per valutare la risposta alle radiazioni nei tessuti normali. Questi organoidi possono essere applicati a futuri studi di cancro in vitro per valutare le interazioni delle cellule tumorali con organoidi irradiati. Le ghiandole mammarie sono state resecate, irradiate a 20 GY e digerite in una soluzione di collagenasi VIII. Gli organoidi epiteliali sono stati separati tramite differenziazione centrifuga e gli organoidi 3D sono stati sviluppati in micropiastre 96 e a bassa adesione. Gli organoidi hanno espresso il caratteristico marcatore epiteliale citcheratina 14. L'interazione macrofage con gli organoidi è stata osservata negli esperimenti di co-coltura. Questo modello può essere utile per studiare le interazioni tumorale-stromali, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la polarizzazione dei macrofati all'interno di un microambiente irradiato.
Introduzione
Circa il 60% dei pazienti con triplo cancro al seno negativo (TNBC) sceglie la terapia di conservazione del seno (BCT) come forma di trattamento1. In questa modalità di trattamento, il tumore contenente parte del tessuto mammario viene rimosso, e il tessuto normale circostante è esposto a radiazioni ionizzanti per uccidere eventuali cellule tumorali residue. Il trattamento riduce la recidiva in gran parte della popolazione di cancro al seno; Tuttavia, circa 13,5% dei pazienti trattati con TNBC esperienza locoregionale recidive2. Pertanto, studiando come la radiazione può reclutare cellule tumorali circolanti (CTCs) porte....
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Protocollo
Gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e i protocolli istituzionali approvati dal Comitato istituzionale di cura e uso degli animali Vanderbilt University.
1. preparazione di topi e l'acquisizione di cellule (adattato da Nguyen-Ngoc et al.11)
- Sacrificio atimici nu/nu topi (8-10 settimane di età) utilizzando Co2 asfissia seguita da lussazione cervicale. Pulire la pelle utilizzando 70% etanolo.
- Reinviare le ghiandole mammarie addominali e inguinali dai topi utilizzando forbici pre-sterilizzate e pinze. Rimuovere i linfonodi prima della resezione. Risc....
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Risultati
Gli organoidi mammari epiteliali irradiati sono stati ottenuti con successo dalle ghiandole mammarie del topo, elaborati e coltivati su piastre a bassa adesione (Figura 1). La resa organoide è stata testata dalla semina in diversi ambienti di crescita (Figura 2a-G). La semina delle cellule direttamente sulla coltura tissutale trattata di piastre cellulari da 10 cm ha prodotto una crescita eccessiva delle cellule fibroblasti. I fibroblasti sono stati identificati sotto micros.......
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Discussione
In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo per la crescita riproducibile e la caratterizzazione di organoidi mammari irradiati (Figura 1). Una dose di irradiazione di 20 GY è stata applicata allo specchio precedenti modelli in vivo di reclutamento di cellule tumorali5. L'irradiazione delle ghiandole mammarie ex vivo prima della formazione organoide ha permesso di isolare gli effetti di danno da radiazioni senza una corrispondente infiltrazione di cellule immun.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Dott. ssa Laura L. Bronsart per aver fornito GFP e i macrofagi RAW 264,7 con etichetta dTomato. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH Grant #R00CA201304.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10% Formalina tamponata neutra | VWR | 16004-128 | |
| Anti-citocheratina 14 | abcam | ab181595 | Lotto: GR3200524-3 |
| Siero bovino Albumina | Sigma | A1933-25G | |
| Collagene di tipo I | Corning | 354236 | |
| Collagenasi da Clostridium Histolyticum, tipo VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenasi I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Caderina | Segnalazione cellulare | 24E10 | Lotto: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicina | Gibco | 15750 | |
| Capra anti-coniglio secondario | abcam ab150077 | verde Lotto: GR3203000-1 | |
| Capra anti-coniglio secondario | abcam | ab150080 | rosso Lotto: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lotto: TG2611041 |
| Insulina (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulina-Transferrina-Selenio, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (membrana basale estratta dal sarcoma del topo di Engelbreth-Holm-Swarm) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 pozzetti | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | ||
| Falloidina | abcam | ab176757 | Lotto: GR3214582-16 |
| Proteina a giunzione stretta 1 | Novus | NBP1-85047 | Lotto: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole) | Sigma | X100-100ML | |
| Tripsina | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Monolaurato di polietilenglicole sorbitano) | Sigma | P1379-100ML |
Riferimenti
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K.
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Ristampe e permessi
