Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen
Summary
Organoide, die sich aus den Meeressammrissen entwickelten, wurden bestrahlt und charakterisiert, um epitheliale Merkmale und Wechselwirkungen mit Immunzellen zu beurteilen. Bestrahlte Organoide können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit Zellen besser zu bewerten, die zu der Rekrutierung von Tumorzellen in bestrahltem normalem Gewebe führen können.
Abstract
Organoide, die aus dem verdauten Gewebe gewonnen werden, sind mehrstufige dreidimensionale (3D) Konstrukte, die in vivo-Bedingungen besser rekapitulieren als Zellmonolayers. Obwohl sie nicht vollständig in vivo-Komplexität modellieren können, behalten sie eine gewisse Funktionalität der ursprünglichen Orgel. Bei Krebsmodellen werden Organoide häufig verwendet, um Tumorzelleinfälle zu untersuchen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Organoide aus dem normalen und bestrahlten Maus-Mammargewebe zu entwickeln und zu charakterisieren, um die Strahlenreaktion in normalen Geweben zu bewerten. Diese Organoide können in zukünftigen In-vitro-Krebs-Studien eingesetzt werden, um Tumorzellinteraktionen mit bestrahlten Organoiden zu bewerten. Die Brustdrüsen wurden resutiert, auf 20 Gy bestrahlt und in einer Kollagenase VIII Lösung verdaut. Epitheliale Organoide wurden durch Zentrifugaldifferenzierung getrennt, und 3D-Organoide wurden in 96-gut niedrig haftenden Mikroplatten entwickelt. Organoide drückten das charakteristische epitheliale Marker Cytokeratin 14 aus. Die Makrophage-Interaktion mit den Organoiden wurde in Ko-Kultur-Experimenten beobachtet. Dieses Modell kann nützlich sein, um Tumorstrominteraktionen, Infiltration von Immunzellen und Makrophage-Polarisation in einer bestrahlten Mikroumgebung zu untersuchen.
Introduction
Etwa 60% der dreifachen negativen Brustkrebspatientinnen (TNBC) wählendieBrustkonservierungstherapie (BCT) als Behandlungsform 1. Bei dieser Behandlungsmodalität wird der Tumor, der einen Teil des Brustgewebes enthält, entfernt, und das umgebende normale Gewebe ist ionisierender Strahlung ausgesetzt, um alle verbleibenden Tumorzellen abzutöten. Die Behandlung reduziert die Wiederholung in weiten Teilen der Brustkrebspopulation; Allerdings sind etwa 13,5% der behandelten Patienten mit TNBCErfahrunglocoregional Wiederholungen 2. Daher wird die Untersuchung, wie Strahlung zirkulierende Tumorzellen rekrutieren kann (CTCs), zu wichtigen Einsichten in die lokale Wiederholung 3,4führen.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Strahlung des normalen Gewebes die Rekrutierung verschiedenerZelltypen 5 erhöht. In präklinischen Modellen von TNBC erhöhte die Bestrahlung des normalen Gewebes die Makrophage und in der Folge dieRekrutierung von Tumorzellen auf das normale Gewebe 5. Der Immunstatus beeinflusste die Rekrutierung von Tumorzellen an bestrahlten Standorten, wobei die Tumorzellwanderung bei immunkompromitierten Probanden beobachtet wurde. Die Rekapitulation dieser Wechselwirkungen mit Organoiden aus Brustdrüsen wird die Beobachtung von Zellmigration und zellstromalen Wechselwirkungen in Echtzeit mit Mikroskopie und Live-Zell-Bildgebung ermöglichen, um die Rolle der Strahlenschäden bei der Veränderung zu bestimmen. Tumorzellverhalten.
Maus-Mammarorganoide haben dabei geholfen, wichtige Schritte in der Entwicklung der Brustdrüse aufzuklären. Ein Säugetierorganoid ist ein mehrstufiges, dreidimensionales Konstrukt des isolierten Säugetierepithels, das größer als50 μm6,7,8,9,10ist. Mit Hilfe von primären epithelialen Organoiden bewertete Simian et al.die notwendigen Faktoren für die Verzweigung in der Brustdrüse 7. Shamir et al. entdeckte, dass die Verbreitung ohne einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang erfolgen kann, was Einblick in die metastasierende Kaskade8gewährt. Die Methoden zur Erzeugung und Charakterisierung von Organoiden aus Brustdrüsengewebe sind6,11,12, 13gutetabliert. Unseres Wissens wurden jedoch keine Methoden für den Anbau von bestrahlten Organoiden aus Brustdrüsen gemeldet. Ein Protokoll zum Anbauen und Charakterisieren von bestrahlten Organoiden wäre ein entscheidender Schritt bei der Rekapitulation von strahleninduzierten Immun-und Tumorzellrekrutierungen.
In diesem Papier berichten wir über eine Methode zum Anbauen und Charakterisieren von bestrahlten Säugetierarchivorganoiden in Mikroplatten mit niedrigem Klebstoff-Polymer, das die Bildung von Spheroiden unterstützt. Diese Organoide wurden mit Makrophagen kokultiviert, um die Infiltrationskinetik der Immunzellen zu untersuchen. Diese Arbeit kann erweitert werden, um die Ko-Kulturierung von Organoiden mit Fettzellen zu umfassen, um Säugetiereigenschaften zu rekapitulieren, Brustkrebszellen zur Visualisierung von Tumorzellrekrutierungen und CD8+ T-Zellen, um Wechselwirkungen zwischen Tumorimmel zu untersuchen. Bereits etablierte Protokolle können zur Auswertung von bestrahlten Organoiden verwendet werden. Frühere Modelle, die Säugetierorganoide und Immunzellen mitkultivieren, haben Licht auf Mechanismen der Metastasen und der Verbreitung geworfen. DeNardo et al. fand heraus, dass die CD4+ T-Zellregulierung von tumorassoziierten Makrophagen einen metastasierenden PhenotypvonSäugetieren von Adenokarzinomen 14 verstärkte. Die Modelle der Ko-Kultur-Kultur wurden auch verwendet, um Mechanismen der biologischen Entwicklung zu erklären. Plaks et al. klärte die Rolle der CD4+ T-Zellen als Down-Regulatoren der Säugetierorganogenese15auf. Unsere Gruppe ist jedoch die erste, die ein Verfahren etabliert hat, um zu visualisieren, wie normale Gewebebestrahlung das Immunzellverhalten beeinflusst. Da sich gezeigt hat, dass normale Gewebebestrahlung dieRekrutierung von Tumorzellen verbessert hat. [5] Dieses Protokoll kann weiterentwickelt werden, um zu analysieren, wie das Verhalten der Tumorzellen durch die Bestrahlung von normalem Gewebe und Zellen verändert wird, was zu einem besseren Verständnis von Krebserkrankung wiederholt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir eine Methode für reproduzierbares Wachstum und Charakterisierung von bestrahlten Säugetierorganoiden entwickelt (Abbildung1). Eine Bestrahlungsdosis von 20 Gy wurde auf Spiegel früherer in vivo-Modellen der Tumorzellrekrutierung5angewendet. Die Bestrahlung der Brustdrüsen ex vivo vor der Organoidbildung ermöglichte die Isolierung von Strahlenschädefeffekten ohne eine entsprechende Infiltration von Immunzellen. Die Entwicklung eines …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Laura L. Bronsart für die Bereitstellung von GFP und dTomato-Bezeichnung RAW 264.7Makrophagen. Diese Forschung wurde durch das NIH-Stipendium #R00CA201304 finanziell unterstützt.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
Riferimenti
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Ricerca sul cancro. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochimica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
