التقييم السريع لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي
Summary
وتستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي لتقييم سمية المركبات الكيميائية. وهي تتطور خارجيا وحساسة للمواد الكيميائية، مما يسمح بالكشف عن التغيرات الفينوتية خفية. تتطلب التجربة فقط كمية صغيرة من المركب، والتي تضاف مباشرة إلى لوحة تحتوي على الأجنة، مما يجعل نظام الاختبار فعالة وفعالة من حيث التكلفة.
Abstract
وسمك الحمار الوحشي هو كائن نموذجي للفقاريات يستخدم على نطاق واسع للمرض واكتشاف المخدرات القائمة على النمط الظاهري. سمك الحمار الوحشي يولد العديد من الذرية، لديه أجنة شفافة والتنمية الخارجية السريعة. وبالتالي، يمكن أيضا استخدام أجنة سمك الحمار الوحشي للتقييم السريع لسمية الأدوية الثمينة والمتاحة بكميات صغيرة. ويرد في هذه المادة وصف لطريقة الفحص الفعال لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة ما بعد الإخصاب لمدة تفي بمدة تبعد 1-5 أيام. يتم رصد الأجنة بواسطة مجهر مجسم للتحقيق في العيوب الفينوتية الناجمة عن التعرض لتركيزات مختلفة من المركبات. كما يتم تحديد تركيزات نصف قصوى قاتلة (LC50)من المركبات. تطلبت هذه الدراسة 3-6 ملغ من مركب مثبط، والتجربة بأكملها تستغرق حوالي 8-10 ساعة لإكمالها من قبل فرد في مختبر يحتوي على مرافق أساسية. البروتوكول الحالي مناسب لاختبار أي مركب لتحديد الآثار السمية أو غير المستهدفة التي لا تطاق للمركب في المرحلة المبكرة من اكتشاف المخدرات والكشف عن الآثار السامة الخفية التي قد تفوت في ثقافة الخلية أو غيرها من النماذج الحيوانية. وتقلل هذه الطريقة من التأخيرات الإجرائية وتكاليف تطوير المخدرات.
Introduction
إن تطوير المخدرات عملية مكلفة. قبل أن يتم الموافقة على مجمع كيميائي واحد من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) يتم فحص عدة آلاف من المركبات بتكلفة أكثر من مليار دولار1. خلال التنمية ما قبل السريرية، ومطلوب الجزء الأكبرمن هذه التكلفة لاختبار الحيوان 2. للحد من التكاليف، يحتاج الباحثون في مجال تطوير المخدرات نماذج بديلة لفحص سلامة المركبات الكيميائية3. ولذلك ، في المرحلة المبكرة من تطوير المخدرات ، سيكون من المفيد جدا استخدام طريقة يمكن أن تقيم بسرعة سلامة وسمية المركبات في نموذج مناسب. هناك العديد من البروتوكولات التي تم استخدامها لفحص سمية المركبات الكيميائية التي تنطوي على نماذج زراعة الحيوانات والخلايا ولكنلا يوجد بروتوكول واحد يتم التحقق من صحته وهو في الاستخدام المشترك 4،5. البروتوكولات القائمة باستخدام حمار وحشي تختلف في الطول، وقد استخدمت من قبل الباحثين الفردية الذين قاموا بتقييم السمية وفقا لمتطلبات الراحةالخاصةبهم 6،7،8،9، 10 سنوات , 11 , 12.
في الماضي القريب، ظهرت سمك الحمار الوحشي كنموذج مناسب لتقييم سمية المركبات الكيميائية أثناءالتطور الجنيني 6،7. حمار وحشي لديه العديد من المزايا المضمنة لتقييم المركبات الكيميائية13. حتى التجارب على نطاق واسع قابلة، كما يمكن للأنثى حمار وحشي وضع دفعات من 200-300 البيض، والتي تتطور بسرعة خارج الجسم الحي، لا تحتاج إلى تغذية خارجية لمدة تصل إلى أسبوع وشفافة. يمكن إضافة المركبات مباشرة إلى الماء، حيث يمكن (اعتمادا على طبيعة المجمع) تنتشر من خلال الشيوريون، وبعد الفقس، من خلال الجلد والخياشيم والفم من اليرقات. التجارب لا تتطلب كميات وفيرة من المركبات الكيميائية14 بسبب صغر حجم الجنين. تطوير أجنة حمار وحشي تعبر عن معظم البروتينات اللازمة لتحقيق نتيجة النمو الطبيعي. ولذلك، فإن جنين سمك الحمار الوحشي هو نموذج حساس لتقييم ما إذا كان دواء محتمل يمكن أن يزعج وظيفة البروتين أو جزيء إشارة ذات أهمية التنمية. تصبح أجهزة سمك الحمار الوحشي وظيفية بين 2-5 dpf15، والمركبات التي هي سامة خلال هذه الفترة الحساسة من التطور الجنيني تحفز العيوب الفينوتية في يرقات حمار وحشي. هذه التغييرات phenotypic يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام المجهر بسيطة دون تقنيات الغازية11. وتستخدم على نطاق واسع أجنة حمار وحشي في البحوث السمية بسبب تعقيدها البيولوجي أكبر بكثير بالمقارنة مع فحص المخدرات في المختبر باستخدام نماذج ثقافة الخلايا16،17. كما الفقاريات، والتركيب الوراثي والفيزيولوجي من حمار وحشي قابلة للمقارنة مع البشر، وبالتالي سمية المركبات الكيميائية متشابهة بين حمار وحشي والبشر8،18،19، 20 , 21 , ٢٢– وبالتالي، فإن سمك الحمار الوحشي أداة قيمة في المرحلة الأولى من اكتشاف المخدرات لتقييم سمية وسلامة المركبات الكيميائية.
في هذه المقالة، نقدم وصفا مفصلا للطريقة المستخدمة لتقييم سلامة وسمية مركبات مثبطات الأنهيدراز الكربونية (CA) باستخدام 1-5 أيام بعد الإخصاب (dpf) أجنة حمار وحشي من قبل باحث واحد. ويشمل البروتوكول تعريض أجنة سمك الحمار الوحشي لتركيزات مختلفة من مركبات المثبطات الكيميائية ودراسة الوفيات والتغيرات الفينوتية أثناء التطور الجنيني. في نهاية التعرض للمركبات الكيميائية، يتم تحديد جرعة LC50 من المادة الكيميائية. الطريقة تسمح للفرد لإجراء فحص فعال من 1-5 مركبات الاختبار ويستغرق حوالي 8-10 ساعة اعتماداعلى تجربة الشخص مع الطريقة (الشكل 1). ويرد في الشكل 2بيان لكل خطوة من الخطوات المطلوبة لتقييم سمية المركبات. يتطلب تقييم سمية مثبطات CA 8 أيام، ويشمل إعداد أزواج التزاوج (اليوم 1)؛ جمع الأجنة من خزانات تربية وتنظيفونقلها إلى حاضنة 28.5 درجة مئوية (اليوم 2)؛ توزيع الأجنة في آبار لوحة 24 بئر وإضافة مركبات مثبطات CA المخففة (اليوم 3)؛ تحليل الفينوتيبيك والتصوير من اليرقات (اليوم 4-8)، وتحديد جرعة LC50 (day8). هذه الطريقة سريعة وفعالة، ويتطلب كمية صغيرة من المركب الكيميائي والمرافق الأساسية فقط من المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
في اختبار السمية في المختبر باستخدام الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عن البقاء على قيد الحياة والدراسات المورفولوجية للخلايا التي توفر معلومات محدودة عن السمية الناجمة عن مركب الاختبار. وميزة فحص سمية المركبات الكيميائية التي تستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي هي الكشف السريع عن التغيرات …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل بمنح من مؤسسة سيغريد جوسيليوس (SP, MP), المؤسسة الثقافية الفنلندية (AA, MH), أكاديمية فنلندا (SP, MP), أوريون فارموس مؤسسة (MH), مؤسسة تامبيري للسل (SP, MH وMP) وجين وأتوس إركو مؤسسة (SP وMP ). نشكر متعاونينا الإيطالي والفرنسي، البروفيسور سوبوران، والبروفيسور وينوم، على توفير مثبطات أنهيدراز الكربونية لتقييم السلامة والسمية لأغراض تطوير الأدوية المضادة للسل والسرطان. ونشكر أوليكي ليموس وماريان كوسلاتي على المساعدة التقنية. كما نشكر لينا ماكينن وهانالينا بيبو على مساعدتهما في تربية أسماك الحمار الوحشي وجمع الأجنة. نشكر باخلاص هارلان باركر على التقييم النقدي للمخطوطة والتعليقات الثاقبة.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
Riferimenti
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research–advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
