Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra
Summary
Los embriones de pez cebra se utilizan para evaluar la toxicidad de los compuestos químicos. Se desarrollan externamente y son sensibles a los productos químicos, lo que permite la detección de cambios fenotípicos sutiles. El experimento sólo requiere una pequeña cantidad de compuesto, que se añade directamente a la placa que contiene embriones, haciendo que el sistema de prueba sea eficiente y rentable.
Abstract
El pez cebra es un organismo modelo de vertebrados ampliamente utilizado para la enfermedad y el descubrimiento de fármacos basados en fenotipos. El pez cebra genera muchos vástagos, tiene embriones transparentes y un rápido desarrollo externo. Por lo tanto, los embriones de pez cebra también pueden utilizarse para la evaluación rápida de la toxicidad de los medicamentos que son preciosos y están disponibles en pequeñas cantidades. En el presente artículo, se describe un método para el cribado eficiente de la toxicidad de los compuestos químicos utilizando embriones postfecatización de 1-5 días. Los embriones son monitoreados por estereomicroscopio para investigar los defectos fenotípicos causados por la exposición a diferentes concentraciones de compuestos. También se determinan las concentraciones letales medias máximas (LC50) de los compuestos. El presente estudio requirió 3-6 mg de un compuesto inhibidor, y todo el experimento toma alrededor de 8-10 h para ser completado por un individuo en un laboratorio que tiene instalaciones básicas. El protocolo actual es adecuado para probar cualquier compuesto para identificar efectos tóxicos o fuera del objetivo intolerables del compuesto en la fase temprana del descubrimiento de fármacos y para detectar efectos tóxicos sutiles que pueden perderse en el cultivo celular u otros modelos animales. El método reduce los retrasos procesales y los costos del desarrollo de medicamentos.
Introduction
El desarrollo de medicamentos es un proceso costoso. Antes de que un solo compuesto químico sea aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) varios miles de compuestos se examinan a un costo de más de mil millones de dólares1. Durante el desarrollo preclínico, la mayor parte de este costo es necesaria para las pruebas con animales2. Para limitar los costos, los investigadores en el campo del desarrollo de fármacos necesitan modelos alternativos para el control de seguridad de los compuestos químicos3. Por lo tanto, en la fase temprana del desarrollo del fármaco, sería muy beneficioso utilizar un método que puede evaluar rápidamente la seguridad y toxicidad de los compuestos en un modelo adecuado. Existen varios protocolos que se han utilizado para el cribado de toxicidad de compuestos químicos que involucran modelos decultivo animal y celular, pero no hay un solo protocolo que se valide y sea de uso común 4,5. Los protocolos existentes que utilizan peces cebra varían en longitud y han sido utilizados por investigadores individuales que evaluaron la toxicidad según su requisito de conveniencia6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
En el pasado reciente, el pez cebra ha surgido como un modelo conveniente para la evaluación de la toxicidad de los compuestos químicos durante el desarrollo embrionario6,7. El pez cebra tiene muchas ventajas incorporadas para la evaluación de compuestos químicos13. Incluso los experimentos a gran escala son susceptibles, ya que una hembra de pez cebra puede poner lotes de 200-300 huevos, que se desarrollan rápidamente exvivo, no necesitan alimentación externa hasta por una semana y son transparentes. Los compuestos se pueden añadir directamente en el agua, donde pueden (dependiendo de la naturaleza del compuesto) difundir a través del coro, y después de la eclosión, a través de la piel, branquias y boca de larvas. Los experimentos no requieren cantidades copiosas de compuestos químicos14 debido al pequeño tamaño del embrión. El desarrollo de embriones de pez cebra expresan la mayoría de las proteínas necesarias para lograr el resultado normal del desarrollo. Por lo tanto, un embrión de pez cebra es un modelo sensible para evaluar si un fármaco potencial puede perturbar la función de una proteína o molécula de señalización que es significativa desde el desarrollo. Los órganos del pez cebra se vuelven funcionales entre 2-5 dpf15,y los compuestos que son tóxicos durante este período sensible de desarrollo embrionario inducen defectos fenotípicos en larvas de peces cebra. Estos cambios fenotípicos se pueden detectar fácilmente utilizando un microscopio simple sin técnicas invasivas11. Los embriones zebrafish son ampliamente utilizados en la investigación toxicológica debido a su complejidad biológica mucho mayor en comparación con el cribado in vitro de fármacos utilizando modelos de cultivo celular16,17. Como vertebrado, la composición genética y fisiológica del pez cebra es comparable a lade los seres humanos y, por lo tanto, las toxicidades de los compuestos químicos son similares entre los peces cebra y los humanos 8,18,19, 20 , 21 , 22. Zebrafish es, por lo tanto, una herramienta valiosa en la fase temprana del descubrimiento de fármacos para la evaluación de la toxicidad y la seguridad de los compuestos químicos.
En el presente artículo, proporcionamos una descripción detallada del método utilizado para evaluar la seguridad y toxicidad de los compuestos inhibidores de la anhidrasa carbónica (CA) utilizando embriones de pez cebra post fecundación (dpf) de 1-5 días por un solo investigador. El protocolo consiste en exponer embriones de pez cebra a diferentes concentraciones de compuestos inhibidores químicos y estudiar la mortalidad y los cambios fenotípicos durante el desarrollo embrionario. Al final de la exposición a los compuestos químicos, se determina la dosis DE LC50 del producto químico. El método permite a un individuo llevar a cabo un cribado eficiente de 1-5 compuestos de prueba y toma alrededor de 8-10 h dependiendo de la experiencia de la persona con el método (Figura1). Cada uno de los pasos necesarios para evaluar la toxicidad de los compuestos se describe en la Figura2. La evaluación de la toxicidad de los inhibidores de CA requiere 8 días, e incluye la creación de pares de apareamiento (día 1); recogida de embriones de tanques de cría, limpiándolos y transfiriéndolos a la incubadora de 28,5oC (día 2); distribución de los embriones en los pocillos de una placa de 24 pocillos y adición de compuestos inhibidores de CA diluidos (día 3); análisis fenotípico e imágenes de larvas (día 4-8) y determinación de la dosis de LC50 (día8). Este método es rápido y eficiente, requiere una pequeña cantidad del compuesto químico y sólo las instalaciones básicas del laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de toxicidad in vitro utilizando células cultivadas puede detectar la supervivencia y los estudios morfológicos de las células proporcionando información limitada sobre la toxicidad inducida por el compuesto de ensayo. La ventaja del cribado de toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra es la detección rápida de cambios fenotípicos inducidos químicamente en todo un animal durante el desarrollo embrionario en un organismo modelo relevante. Aproximadamente el 70% de los gen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Sigrid Juselius (SP, MP), la Fundación Cultural Finlandesa (AA, MH), la Academia de Finlandia (SP, MP), la Fundación Orion Farmos (MH), la Fundación Tampere Tuberculosis (SP, MH y MP) y la Fundación Jane y Aatos Erkko (SP y MP) ). Agradecemos a nuestros colaboradores italianos y franceses, el profesor Supuran y el profesor Winum, por proporcionar inhibidores de la anhidrasa carbónica para la evaluación de la seguridad y la toxicidad con fines de desarrollo de fármacos contra la tuberculosis y contra el cáncer. Agradecemos a Aulikki Lehmus y Marianne Kuuslahti por la asistencia técnica. También agradecemos a Leena M’kinen y Hannaleena Piippo por su ayuda con la cría de peces cebra y la recolección de embriones. Agradecemos sinceramente a Harlan Barker por la evaluación crítica del manuscrito y comentarios perspicaces.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
Riferimenti
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