הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish
Summary
עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.
Abstract
הדג הוא אורגניזם בשימוש נרחב בעלי חוליות מודל עבור המחלה והפניטיפ מבוססי גילוי סמים. הדגים מייצרים צאצאים רבים, יש עוברים שקופים ופיתוח חיצוני מהיר. עוברי הדגים מסוגלים, לפיכך, לשמש גם להערכה מהירה של רעילות של תרופות יקרות וזמינות בכמויות קטנות. במאמר הנוכחי, שיטה להקרנה יעילה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות העוברים הפריה יום 1-5 לאחר הימים מתואר. העוברים מנוטרים על ידי הstereomicroscope כדי לחקור את הפגמים פנוטיפקס הנגרמים על ידי החשיפה לריכוזים שונים של תרכובות. ריכוזים קטלניים חצי מקסימלית (LC50) של תרכובות נקבעות גם. המחקר הנוכחי נדרש 3-6 מ”ג של תרכובת מעכב, ואת הניסוי כולו לוקח כ 8-10 h להסתיים על ידי אדם במעבדה שיש מתקנים בסיסיים. הפרוטוקול הנוכחי מתאים לבדיקת כל תרכובת לזיהוי השפעות רעילות בלתי נסבלת או מחוץ למטרה של התרכובת בשלב המוקדם של גילוי הסמים ולגילוי אפקטים רעילים עדינים שעלולים להחמיץ בתרבות התאית או בדגמי בעלי חיים אחרים. השיטה מפחיתה עיכובים פרוצדורליים ועלויות של פיתוח סמים.
Introduction
פיתוח הסמים הוא תהליך יקר. לפני מתחם כימי יחיד אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) והסוכנות האירופית תרופות (EMA) כמה אלפי תרכובות מוקרנים בעלות של מעל 1,000,000,000 דולר1. במהלך הפיתוח הקדם-קליני, החלק הגדול ביותר של עלות זו נדרש עבור בדיקת החיות2. כדי להגביל את העלויות, חוקרים בתחום פיתוח התרופה זקוקים למודלים חלופיים להקרנה בטיחות של תרכובות כימיות3. לכן, בשלב המוקדם של התפתחות התרופה, זה יהיה מאוד מועיל להשתמש בשיטה שיכולה להעריך במהירות את הבטיחות והרעילות של תרכובות במודל מתאים. ישנם מספר פרוטוקולים ששימשו להקרנה רעילות של תרכובות כימיות מעורבים בעלי חיים ומודלים של תרבות התא, אבל אין פרוטוקול אחד כי הוא מאומת והוא בשימוש משותף4,5. פרוטוקולים קיימים באמצעות דג זברה להשתנות באורך ושימשו על ידי חוקרים בודדים אשר העריכו את רעילות לפי דרישת הנוחות שלהם6,7,8,9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , . שתיים עשרה
בעבר האחרון, דג דג זברה התפתחה כמודל נוח להערכת רעילות של תרכובות כימיות במהלך התפתחות עובריים6,7. לדג יש יתרונות רבים ומובנים להערכת תרכובות כימיות13. אפילו ניסויים בקנה מידה גדול הם קלה, כמו נקבה דג זברה יכול להטיל אצוות של 200-300 ביצים, אשר לפתח במהירות ex vivo, לא צריך האכלה חיצונית עד שבוע והם שקופים. את התרכובות ניתן להוסיף ישירות לתוך המים, שם הם יכולים (בהתאם לאופי המתחם) לפזר דרך chorion, ואחרי הבקיעה, דרך העור, זימים והפה של הזחלים. הניסויים אינם דורשים כמויות שפע של תרכובות כימיות14 בשל הגודל הקטן של העובר. פיתוח העוברים ומבטאים את רוב החלבונים הדרושים כדי להשיג את התוצאה ההתפתחותית נורמלית. לכן, עובר דג הוא מודל רגיש כדי להעריך אם תרופה פוטנציאלית יכול להפריע לתפקוד של חלבון או מולקולה איתות כי הוא משמעותי בפיתוח. האיברים של דג דג זברה להיות פונקציונלי בין 2-5 dpf15, ותרכובות רעילים במהלך תקופה זו רגיש של ההתפתחות העובריים לגרום למומים פנוטילים בזחלים דג זברה. שינויים אלה גמישות פנוטיפית ניתן לזהות בקלות באמצעות מיקרוסקופ פשוט ללא טכניקות פולשני11. עוברי הדגים משמשים רבות במחקר רעילות בגלל המורכבות הביולוגית הרבה יותר שלהם בהשוואה לסינון סמים מחוץ לתחום באמצעות מודלים של תרבות התאים16,17. כמו בעלי חוליות, האיפור הגנטי הפיזיולוגי של דג דג זברה הוא דומה לבני אדם ולכן רעלים של תרכובות כימיות דומים בין דג זברה ובני אדם8,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , 22. zebrafish הוא, לפיכך, כלי חשוב בשלב מוקדם של גילוי סמים להערכת רעילות ובטיחות של תרכובות כימיות.
במאמר הנוכחי, אנו מספקים תיאור מפורט של השיטה המשמשת להערכת הבטיחות והרעילות של תרכובות המעכב (CA) מעכב פחמניים באמצעות 1-5 היום הפריה הפוסט (dpf) דג זברה העוברים על ידי חוקר יחיד. הפרוטוקול כולל חשיפת עוברי דגים בריכוזים שונים של תרכובות מעכבי כימיים ללמוד את התמותה ואת השינויים פנוטיפקס במהלך ההתפתחות העוברית. בסוף החשיפה לתרכובות כימיות, מינון LC50 של הכימיקל נקבע. השיטה מאפשרת לאדם לבצע הקרנה יעילה של 1-5 תרכובות בדיקה ולוקח כ 8-10 h בהתאם לניסיון של האדם עם השיטה (איור 1). כל אחד מהצעדים הנדרשים להערכת רעילות התרכובות מתואר באיור 2. הערכת רעילות של מעכבי CA דורש 8 ימים, כולל הגדרת זוגות ההזדווגות (יום 1); איסוף העוברים ממיכלי הרבייה, ניקוי והעברתו לאינקובטור 28.5 ° c (יום 2); התפלגות העוברים לבארות של הצלחת 24-באר ותוספת של תרכובות המעכב מדולל CA (יום 3); הניתוח פנוטימית והדמיה של הזחלים (יום 4-8), וקביעת מינון LC50 (day8). שיטה זו מהירה ויעילה, מחייבת כמות קטנה של תרכובת כימית ורק מתקנים בסיסיים של המעבדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במבחן רעילות מחוץ לבית באמצעות תאים מתורבתים יכול לזהות הישרדות מחקרים מורפולוגיים של התאים מתן מידע מוגבל על רעילות הנגרמת על ידי מתחם הבדיקה. היתרון של הקרנת רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי דג זברה הוא גילוי מהיר של שינויים המושרה בכימיקלים פנוטיפקס בעלי חיים שלמים במהלך ה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה היה נתמך על ידי מענקים Sigrid Juselius קרן (SP, MP), בקרן התרבות הפינית (AA, MH), האקדמיה של פינלנד (SP, MP), אוריון Farmos קרן (MH), שחפת טמפרה קרן (SP, MH ו-MP) וג ואטוס Erkko קרן (SP ו-MP ). אנו מודים למשתפי-הפעולה האיטלקיים והצרפתיים שלנו, פרופ ‘ סופורו ופרופ ‘ וינר, למתן מעכבי אנהיהידרסה בתחום הבטיחות והרעילות למטרות אנטי-TB ופיתוח תרופות נגד סרטן. אנו מודים לאויקקי להמן ולמריאן Kuuslahti על הסיוע הטכני. אנו מודים גם ללינה מנדיסן והאנניאנה פיפו על עזרתם בגידול הדגים ובאיסוף העוברים. בכנות, אנו מודים להארלן בארקר על הערכה קריטית של כתב היד והערות תובנה.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
Riferimenti
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research–advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
