Zebrafish embryoner anvendes til at evaluere toksiciteten af kemiske forbindelser. De udvikler sig eksternt og er følsomme over for kemikalier, hvilket gør det muligt at påvise subtile fænotypiske forandringer. Eksperimentet kræver kun en lille mængde af sammensatte, som er direkte føjet til pladen, der indeholder embryoner, hvilket gør testsystemet effektivt og omkostningseffektivt.
Den Zebra er en udbredte hvirveldyr model organisme for sygdommen og fænotype-baserede Drug Discovery. Den Zebra genererer mange afkom, har gennemsigtige embryoner og hurtig ekstern udvikling. Zebrafish-embryoner kan derfor også anvendes til hurtig vurdering af toksiciteten af de lægemidler, der er dyrebare og tilgængelige i små mængder. I denne artikel beskrives en metode til effektiv screening af toksiciteten af kemiske forbindelser, der anvender 1-5-dages efter befrugtnings embryoner. Embryonerne overvåges af stereomicroskop for at undersøge de fænotypiske defekter, der forårsages af eksponeringen for forskellige koncentrationer af forbindelser. Halv-maximale dødelige koncentrationer (LC50) af forbindelserne bestemmes også. Den nuværende undersøgelse krævede 3-6 mg af en inhibitor sammensatte, og hele eksperimentet tager omkring 8-10 h, der skal udfyldes af en person i et laboratorium, der har grundlæggende faciliteter. Den nuværende protokol er egnet til at teste enhver forbindelse til at identificere uacceptable toksiske eller off-Target effekter af forbindelsen i den tidlige fase af Drug Discovery og til at opdage subtile toksiske virkninger, der kan blive savnet i cellekulturen eller andre dyremodeller. Metoden mindsker procedure forsinkelser og omkostninger til narkotika udvikling.
Narkotika udvikling er en kostbar proces. Før en enkelt kemisk forbindelse er godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) flere tusinde forbindelser screenes til en pris på over 1.000.000.000 dollars1. Under den prækliniske udvikling, den største del af denne omkostning er nødvendig for dyreforsøg2. For at begrænse omkostningerne har forskere inden for narkotika udvikling brug for alternative modeller til sikkerhedsscreening af kemiske forbindelser3. Derfor, i den tidlige fase af lægemiddel udviklingen, ville det være meget gavnligt at bruge en metode, der hurtigt kan evaluere sikkerheden og toksiciteten af forbindelserne i en passende model. Der er flere protokoller, der er blevet anvendt til toksicitets screening af kemiske forbindelser, der involverer dyre-og cellekultur modeller, men der er ikke en enkelt protokol, som er valideret og er til fælles brug4,5. Eksisterende protokoller med Zebra varierer i længden og er blevet brugt af individuelle forskere, der vurderede toksiciteten som pr deres bekvemmelighed krav6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
I den seneste fortid, zebra er dukket op som en bekvem model for vurdering af toksiciteten af kemiske forbindelser under embryonale udvikling6,7. Zebra har mange indbyggede fordele til vurdering af kemiske forbindelser13. Selv store eksperimenter er modtagelige, som en zebra kvinde kan lægge partier af 200-300 æg, som udvikler sig hurtigt ex vivo, behøver ikke ekstern fodring i op til en uge og er gennemsigtige. Forbindelserne kan tilsættes direkte i vandet, hvor de kan (afhængigt af arten af den sammensatte) diffus gennem chorion, og efter klækning, gennem huden, gæller og mund af larver. Forsøgene kræver ikke rigelige mængder af kemiske forbindelser14 på grund af den lille størrelse af embryonet. Udvikle Zebra embryoner udtrykker de fleste af de proteiner, der kræves for at opnå det normale udviklingsmæssige resultat. Derfor er en zebra embryo en følsom model til at vurdere, om et potentielt lægemiddel kan forstyrre funktionen af et protein eller signalerings molekyle, der er udviklingsmæssigt signifikant. De organer af Zebra bliver funktionelle mellem 2-5 DPF15, og forbindelser, der er giftige i denne følsomme periode af embryonale udvikling inducerer fænotypiske defekter i Zebra larver. Disse fænotypiske ændringer kan let påvises ved hjælp af et simpelt mikroskop uden invasive teknikker11. Zebrafish embryoner er meget udbredt i toksikologisk forskning på grund af deres langt større biologisk kompleksitet i forhold til in vitro Drug screening ved hjælp af cellekultur modeller16,17. Som et hvirveldyr er den genetiske og fysiologiske makeup af Zebra sammenlignelig med mennesker, og derfor er toksiciteter af kemiske forbindelser ens mellem Zebra og mennesker8,18,19, 20 , 21 , 22. zebrafish er således et værdifuldt redskab i den tidlige fase af lægemiddel opdagelsen til vurdering af de kemiske forbindelsers Toksicitet og sikkerhed.
I denne artikel giver vi en detaljeret beskrivelse af den metode, der anvendes til at evaluere sikkerheden og toksiciteten af carbonanhydrase (ca)-hæmmer forbindelser ved hjælp af 1-5-dag efter befrugtning (DPF) Zebra embryoner af en enkelt forsker. Protokollen indebærer at udsætte Zebra-embryoner for forskellige koncentrationer af kemiske inhibitor forbindelser og studere dødelighed og fænotypiske forandringer under fosterudviklingen. Ved afslutningen af eksponeringen for de kemiske forbindelser bestemmes LC50 dosis af kemikaliet. Metoden gør det muligt for en person at udføre effektiv screening af 1-5 test forbindelser og tager omkring 8-10 h afhængigt af oplevelsen af den person med metoden (figur 1). Hvert af de skridt, der kræves for at vurdere toksiciteten af forbindelserne er skitseret i figur 2. Vurderingen af toksicitet af CA-hæmmere kræver 8 dage, og omfatter opsætning af parring par (dag 1); opsamling af embryoner fra avls tanke, rengøring og overførsel til 28,5 °C inkubator (dag 2); fordeling af embryonerne i brøndene på en 24-brønd plade og tilsætning af fortyndede CA-inhibitor forbindelser (dag 3); fænotypisk analyse og billeddannelse af larver (dag 4-8) og bestemmelse af LC50 dosis (day8). Denne metode er hurtig og effektiv, kræver en lille mængde af den kemiske forbindelse og kun grundlæggende faciliteter på laboratoriet.
In vitro toksicitetstest ved hjælp af dyrkede celler kan detektere overlevelse og morfologiske undersøgelser af cellerne, der giver begrænsede oplysninger om toksiciteten induceret af teststoffet. Fordelen ved toksicitets screening af kemiske forbindelser ved hjælp af zebrafiskembryoner er hurtig påvisning af kemisk inducerede fænotypiske forandringer i et helt dyr under fosterudviklingen i en relevant model organisme. Omkring 70% af protein-kodning menneskelige gener har orthologs modparter i Zebra genom<…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af tilskud fra Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), finsk kulturfond (AA, MH), Finlands Akademi (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere tuberkulose Foundation (SP, MH og MP) og Jane og Aatos Erkko Foundation (SP og MP ). Vi takker vores italienske og franske samarbejdspartnere, Prof. Supuran, og Prof. Winum, for at levere carbonanhydrasehæmmere for sikkerhed og toksicitet evaluering for anti-TB og anti-cancer Drug udvikling formål. Vi takker Aulikki Lehmus og Marianne Kuuslahti for den tekniske bistand. Vi takker også Leena Mäkinen og hannaleena piippo for deres hjælp med Zebra avl og indsamling af embryoner. Vi oprigtigt takke Harlan Barker for kritisk evaluering af manuskriptet og indsigtsfulde kommentarer.
24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |