ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता का तेजी से मूल्यांकन
Summary
ज़ेब्राफ़िश भ्रूण रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है। वे बाह्य रूप से विकसित होते हैं और रसायनों के प्रति संवेदनशील होते हैं, जिससे सूक्ष्म लक्षणीय परिवर्तनों का पता लगाया जा सकता है। प्रयोग केवल यौगिक की एक छोटी राशि की आवश्यकता है, जो सीधे भ्रूण युक्त प्लेट में जोड़ा जाता है, परीक्षण प्रणाली कुशल और लागत प्रभावी बनाने.
Abstract
जेब्राफ़िश रोग और phenotype आधारित दवा की खोज के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कशेरुकी मॉडल जीव है। जेब्राफ़िश कई संतानों को उत्पन्न करता है, पारदर्शी भ्रूण और तेजी से बाहरी विकास होता है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण, इसलिए भी दवाओं है कि कीमती और छोटी मात्रा में उपलब्ध हैं की विषाक्तता के तेजी से मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान लेख में, 1-5 दिन के बाद निषेचन भ्रूण का उपयोग कर रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता के कुशल स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। यौगिकों के विभिन्न सांद्रता के संपर्क में आने के कारण फेनोटाइपिक दोषों की जांच करने के लिए भ्रूणों की निगरानी स्टीरियोमाइक्रोस्कोप द्वारा की जाती है। यौगिकों की अर्ध-अधिकतम घातक सांद्रता (एलसी50)भी निर्धारित की जाती है। वर्तमान अध्ययन के लिए 3-6 मिलीग्राम एक अवरोधक यौगिक की आवश्यकता होती है, और पूरे प्रयोग के बारे में लेता है 8-10 एच बुनियादी सुविधाओं वाले एक प्रयोगशाला में एक व्यक्ति द्वारा पूरा किया जा करने के लिए. वर्तमान प्रोटोकॉल किसी भी यौगिक परीक्षण के लिए दवा की खोज के प्रारंभिक चरण में यौगिक के असहनीय विषाक्त या बंद लक्ष्य प्रभाव की पहचान करने के लिए और सूक्ष्म विषाक्त प्रभाव है कि सेल संस्कृति या अन्य पशु मॉडल में याद किया जा सकता है का पता लगाने के लिए उपयुक्त है. विधि प्रक्रियात्मक देरी और दवा के विकास की लागत कम कर देता है.
Introduction
औषधि विकास एक महंगी प्रक्रिया है। इससे पहले कि एक भी रासायनिक यौगिक खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और यूरोपीय दवा एजेंसी (EMA) द्वारा अनुमोदित है कई हजार यौगिकों एक अरब डॉलर से अधिक की लागत से जांच कर रहे हैं1. पूर्व नैदानिक विकास के दौरान, इस लागत का सबसे बड़ा हिस्सा पशु परीक्षण2के लिए आवश्यक है। लागत को सीमित करने के लिए, दवा विकास के क्षेत्र में शोधकर्ताओं रासायनिक यौगिकों की सुरक्षा स्क्रीनिंग के लिए वैकल्पिक मॉडल की जरूरत3. इसलिए, दवा के विकास के प्रारंभिक चरण में, यह एक विधि है कि तेजी से सुरक्षा और एक उपयुक्त मॉडल में यौगिकों की विषाक्तता का मूल्यांकन कर सकते हैं का उपयोग करने के लिए बहुत फायदेमंद होगा. ऐसे कई प्रोटोकॉल हैं जो पशु और कोशिका संवर्धन मॉडलों से जुड़े रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता जांच के लिए उपयोग किए गए हैं लेकिन ऐसा एक भी प्रोटोकॉल नहीं है जिसे मान्य किया गया हो और इसका सामान्य उपयोग4,5है . जेब्राफ़िश का उपयोग करने वाले मौजूदा प्रोटोकॉल की लंबाई अलग-अलग होती है और इसका उपयोग अलग-अलग शोधकर्ताओं द्वारा किया जाता है जिन्होंने अपनी सुविधा की आवश्यकता के अनुसार विषाक्तता का मूल्यांकन कियाहै 6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
हाल के दिनों में भ्रूणीय विकास6,7 के दौरान रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए जेब्राफिश एक सुविधाजनक मॉडल के रूप में उभराहै। जेब्राफ़िश रासायनिक यौगिकों13के मूल्यांकन के लिए कई इन-बिल्ट फायदे हैं। यहां तक कि बड़े पैमाने पर प्रयोगों मिलनसार हैं, के रूप में एक ज़ेब्राफ़िश महिला 200-300 अंडे, जो तेजी से पूर्व vivoविकसित के बैचों रखना कर सकते हैं, एक सप्ताह तक के लिए बाहरी खिलाने की जरूरत नहीं है और पारदर्शी हैं. यौगिकों सीधे पानी में जोड़ा जा सकता है, जहां वे कर सकते हैं (कंपाउंड की प्रकृति पर निर्भर करता है) chorion के माध्यम से फैलाना, और hatching के बाद, त्वचा के माध्यम से, gills और लार्वा के मुंह. प्रयोगों में भ्रूण के छोटे आकार के कारण14 रासायनिक यौगिकों की प्रचुर मात्रा की आवश्यकता नहीं होती है। जेब्राफ़िश भ्रूणों का विकास सामान्य विकासात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रोटीनका अधिकांश व्यक्त करता है। इसलिए, एक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण एक संवेदनशील मॉडल का आकलन करने के लिए कि क्या एक संभावित दवा एक प्रोटीन या संकेत अणु है कि विकास महत्वपूर्ण है के समारोह को परेशान कर सकते हैं. जेब्राफ़िश के अंग 2-5 डीपीएफ15के बीच कार्यात्मक हो जाते हैं, और भ्रूण विकास की इस संवेदनशील अवधि के दौरान विषाक्त यौगिक ों के बीच जेब्राफिश लार्वा में फेनोटाइपिक दोष पैदा करते हैं। इन फीनोटाइपिक परिवर्तनों का आसानी से आक्रामक तकनीक11के बिना एक सरल सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है . ज़ेब्राफ़िश भ्रूणों का व्यापक रूप से विषाक् त अनुसंधान में उपयोग किया जाता है , जो कोशिका संस् कृति मॉडल16,17का उपयोग करते हुए इन विट्रो औषध जांच की तुलना में अधिक जैविक जटिलता के कारण विषाक् त अनुसंधान में किया जाता है . कशेरुकी होने के कारण जेब्राफिश का आनुवंशिक और शारीरिक संबंध मनुष्यों से तुलनीय होता है और इसलिए रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता जेब्राफिश और मनुष्योंकेबीच समान होती है8 ,18,19, 20 , 21 , 22. इस प्रकार, रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता और सुरक्षा के मूल्यांकन के लिए दवा की खोज के प्रारंभिक चरण में ज़ेब्राफ़िश एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
वर्तमान लेख में, हम एक ही शोधकर्ता द्वारा 1-5 दिन के बाद निषेचन (dpf) ज़ेबराफ़िश भ्रूण का उपयोग कर कार्बनिक एनहाइड्रेज (सीए) अवरोधक यौगिकों की सुरक्षा और विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया विधि का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल रासायनिक अवरोधक यौगिकों के विभिन्न सांद्रता के लिए ज़ेब्राफ़िश भ्रूण को उजागर करने और भ्रूण के विकास के दौरान मृत्यु दर और phenotypic परिवर्तन का अध्ययन शामिल है. रासायनिक यौगिकों के लिए जोखिम के अंत में, रासायनिक के LC50 खुराक निर्धारित किया जाता है. विधि एक व्यक्ति को 1-5 परीक्षण यौगिकों की कुशल स्क्रीनिंग करने की अनुमति देती है और विधि के साथ व्यक्ति के अनुभव के आधार पर लगभग 8-10 एच लेता है (चित्र 1)। यौगिकों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए आवश्यक प्रत्येक कदम चित्र 2में रेखांकित किया गया है। सीए inhibitors की विषाक्तता के मूल्यांकन 8 दिनों की आवश्यकता है, और संभोग जोड़े की स्थापना भी शामिल है (दिन 1); प्रजनन टैंक से भ्रूण का संग्रह, सफाई और उन्हें 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (दिन 2) में स्थानांतरित; एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में भ्रूण का वितरण और पतला सीए अवरोधक यौगिकों के अलावा (दिन 3); phenotypic विश्लेषण और लार्वा की इमेजिंग (दिन 4-8), और LC के निर्धारण50 खुराक (दिन8). इस विधि तेजी से और कुशल है, रासायनिक यौगिक और प्रयोगशाला के केवल बुनियादी सुविधाओं की एक छोटी राशि की आवश्यकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग कर इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण परीक्षण यौगिक द्वारा प्रेरित विषाक्तता के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करने वाली कोशिकाओं के अस्तित्व और रूपात्मक अध्ययन का पता लगा स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को सिग्रिड जुसेलियस फाउंडेशन (एसपी, एमपी), फिनिश कल्चरल फाउंडेशन (एए, महाराष्ट्र), फिनलैंड की अकादमी (एसपी, एमपी), ओरियन फरमोस फाउंडेशन (एमएच), टैम्पल क्षय रोग फाउंडेशन (एसपी, महाराष्ट्र और एमपी) और जेन और एटोस एर्कको फाउंडेशन (एसपी और एमपी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। ). हम अपने इतालवी और फ्रेंच सहयोगियों, प्रो Supuran, और प्रो Winum, विरोधी टीबी और विरोधी कैंसर दवा विकास प्रयोजनों के लिए सुरक्षा और विषाक्तता मूल्यांकन के लिए कार्बोनिक anhydrase inhibitors प्रदान करने के लिए धन्यवाद. हम तकनीकी सहायता के लिए Aulikki Lehmus और Marianne Kuuslahti धन्यवाद. हम भी जेब्राफ़िश प्रजनन और भ्रूण के संग्रह के साथ उनकी मदद के लिए लीना मकीन और Hannaleena Piippo धन्यवाद. हम ईमानदारी से पांडुलिपि और व्यावहारिक टिप्पणी के महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए Harlan बार्कर धन्यवाद.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
Riferimenti
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