Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish
Summary
Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.
Abstract
O zebrafish é um organismo modelo vertebrado extensamente usado para a descoberta da doença e do phenotype-baseado da droga. O zebrafish gera muitos descendentes, tem embriões transparentes e desenvolvimento externo rápido. Os embriões de zebrafish podem, conseqüentemente, ser usados igualmente para a avaliação rápida da toxicidade das drogas que são preciosas e disponíveis em quantidades pequenas. No presente artigo, descreve-se um método para a triagem eficiente da toxicidade de compostos químicos utilizando embriões de adubação pós-fertilização de 1-5 dias. Os embriões são monitorados por estereomicroscópio para investigar os defeitos fenotípicos causados pela exposição a diferentes concentrações de compostos. Concentrações letais semimáximas (LC50) dos compostos também são determinadas. O presente estudo exigiu 3-6 mg de um composto inibidor, e todo o experimento leva cerca de 8-10 h para ser completado por um indivíduo em um laboratório com instalações básicas. O protocolo atual é apropriado para testar todo o composto para identificar efeitos tóxicos ou fora-alvo intolerável do composto na fase adiantada da descoberta da droga e para detectar os efeitos tóxicos sutis que podem ser faltado na cultura de pilha ou em outros modelos animais. O método reduz os atrasos processuais e os custos do desenvolvimento de fármacos.
Introduction
O desenvolvimento de drogas é um processo caro. Antes de um único composto químico é aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) e Agência Europeia de medicamentos (EMA) vários milhares de compostos são rastreados a um custo de mais de 1.000.000.000 dólares1. Durante o desenvolvimento pré-clínico, a maior parte deste custo é necessária para o teste de animais2. Para limitar os custos, os pesquisadores no campo do desenvolvimento de fármacos necessitam de modelos alternativos para a triagem de segurança de compostos químicos3. Portanto, na fase inicial do desenvolvimento da droga, seria muito benéfico usar um método que possa avaliar rapidamente a segurança e a toxicidade dos compostos em um modelo adequado. Existem vários protocolos que têm sido utilizados para a triagem de toxicidade de compostos químicos envolvendo modelos de cultura animal e celular, mas não há um único protocolo que é validado e está em uso comum4,5. Protocolos existentes usando zebrafish variam de comprimento e têm sido utilizados por pesquisadores individuais que avaliaram a toxicidade de acordo com sua exigência de conveniência6,7,8,9, 10 de , 11 anos de , doze anos.
No passado recente, o zebrafish surgiu como um modelo conveniente para a avaliação da toxicidade de compostos químicos durante o desenvolvimento embrionário6,7. O zebrafish tem muitas vantagens incorporadas para a avaliação de compostos químicos13. Mesmo experimentos em grande escala são amenable, como uma fêmea zebrafish pode colocar lotes de 200-300 ovos, que se desenvolvem rapidamente ex vivo, não precisa de alimentação externa para até uma semana e são transparentes. Os compostos podem ser adicionados diretamente na água, onde podem (dependendo da natureza do composto) difusa através do Chorion, e após a eclosão, através da pele, brânquias e boca de larvas. Os experimentos não necessitam de quantidades copiosas de compostos químicos14 devido ao pequeno tamanho do embrião. O desenvolvimento de embriões de zebrafish expressa a maioria das proteínas necessárias para atingir o desfecho normal do desenvolvimento. Portanto, um embrião zebrafish é um modelo sensível para avaliar se um potencial fármaco pode perturbar a função de uma proteína ou molécula de sinalização que é desenvolvimental significativo. Os órgãos do zebrafish tornam-se funcionais entre 2-5 DPF15, e os compostos que são tóxicos durante este período sensível do desenvolvimento embrionário induzem defeitos fenotípicos em larvas do zebrafish. Estas mudanças fenotípicas podem prontamente ser detectadas usando um microscópio simples sem técnicas invasoras11. Os embriões de zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa toxicológica devido à sua complexidade biológica muito maior em comparação com a triagem de fármacos in vitro utilizando modelos de cultura celular16,17. Como um vertebrado, a composição genética e fisiológica de zebrafish é comparável aos seres humanos e, portanto, toxicidades de compostos químicos são semelhantes entre zebrafish e seres humanos8,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22. zebrafish é, portanto, uma ferramenta valiosa na fase inicial de descoberta de drogas para a avaliação da toxicidade e segurança dos compostos químicos.
No presente artigo, fornecemos uma descrição detalhada do método utilizado para avaliar a segurança e a toxicidade de compostos inibidores da anidrase carbônica (CA) usando embriões de zebrafish de 1-5 dias pós-fertilização (DPF) por um único pesquisador. O protocolo envolve expor embriões de zebrafish a diferentes concentrações de compostos inibidores químicos e estudar a mortalidade e as alterações fenotípicas durante o desenvolvimento embrionário. No final da exposição aos compostos químicos, a dose de LC50 do produto químico é determinada. O método permite que um indivíduo realize uma triagem eficiente de 1-5 compostos de teste e leva cerca de 8-10 h, dependendo da experiência da pessoa com o método (Figura 1). Cada uma das etapas necessárias para avaliar a toxicidade dos compostos é descrita na Figura 2. A avaliação da toxicidade dos inibidores da CA requer 8 dias, e inclui a criação de pares de acasalamento (dia 1); recolha de embriões de tanques reprodutores, limpeza e transferência para a incubadora de 28,5 ° c (dia 2); distribuição dos embriões nos poços de uma placa de 24 poços e adição de compostos inibidores de CA diluídos (dia 3); análise fenotípica e imagem de larvas (dia 4-8) e determinação da dose de LC50 (dia8). Este método é rápido e eficiente, requer uma pequena quantidade do composto químico e apenas instalações básicas do laboratório.
Protocol
Representative Results
Discussion
O teste de toxicidade in vitro utilizando células cultivadas pode detectar a sobrevivência e os estudos morfológicos das células que fornecem informações limitadas sobre a toxicidade induzida pelo composto de teste. A vantagem da seleção da toxicidade de compostos químicos que usam embriões do zebrafish é deteção rápida de mudanças fenotípicas quimicamente induzidas em um animal inteiro durante o desenvolvimento embrionário em um organismo modelo relevante. Aproximadamente 70% dos genes humanos …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Sigrid Juselius (SP, MP), da Fundação Cultural finlandesa (AA, MH), da Academia da Finlândia (SP, MP), da Fundação Orion Farmos (MH), da Fundação Tampere tuberculosis (SP, MH e MP) e da Fundação Jane e Aatos Erkko (SP e MP ). Agradecemos aos nossos colaboradores italianos e franceses, Prof. Supuran, e ao Prof. Winum, por fornecer inibidores de anidrase carbônica para avaliação de segurança e toxicidade para fins de desenvolvimento de drogas ANTITUBERCULOSE e anticancerígenos. Agradecemos a Aulikki Lehmus e Marianne Kuuslahti pela assistência técnica. Agradecemos também Leena Mäkinen e Hannaleena Piippo por sua ajuda com a criação de zebrafish e coleta de embriões. Agradecemos sinceramente Harlan Barker para a avaliação crítica do manuscrito e comentários perspicazes.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
Riferimenti
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