Zebrafish embryon används för att utvärdera toxiciteten av kemiska föreningar. De utvecklas externt och är känsliga för kemikalier, vilket möjliggör detektion av subtila fenotypiska förändringar. Experimentet kräver endast en liten mängd av sammansatta, som direkt tillsätts till plattan som innehåller embryon, vilket gör testsystemet effektivt och kostnadseffektivt.
Zebrafiskar är en allmänt använd ryggradsdjur modellorganism för sjukdomen och fenotyp-baserade drogen upptäckt. Zebrafiskar genererar många avkomman, har transparenta embryon och snabb extern utveckling. Zebrafish embryon kan därför också användas för en snabb utvärdering av toxiciteten hos de läkemedel som är värdefulla och finns i små mängder. I denna artikel beskrivs en metod för effektiv screening av toxiciteten av kemiska föreningar med hjälp av 1-5-dagars post fertilisering embryon. Embryona övervakas av stereomikroskopet för att undersöka fenotypiska defekter orsakade av exponering för olika koncentrationer av föreningar. Halva maximala dödliga koncentrationer (LC50) av föreningarna bestäms också. Den nuvarande studien krävde 3-6 mg en inhibitor förening, och hela experimentet tar ca 8-10 h som skall fyllas i av en individ i ett laboratorium med grundläggande faciliteter. Det nuvarande protokollet är lämplig för att testa någon förening för att identifiera oacceptabla toxiska eller off-Target effekter av föreningen i den tidiga fasen av Drug discovery och att upptäcka subtila toxiska effekter som kan missas i cellkulturen eller andra djurmodeller. Metoden minskar förseningarna i förfarandet och kostnaderna för läkemedelsutveckling.
Läkemedelsutveckling är en dyr process. Innan en enda kemisk förening är godkänd av Food and Drug Administration (FDA) och Europeiskaläkemedelsmyndigheten (EMA) flera tusen föreningar screenas till en kostnad av över 1 000 000 000 dollar1. Under den prekliniska utvecklingen krävs den största delen av denna kostnad för djurförsök2. För att begränsa kostnaderna behöver forskare inom området läkemedelsutveckling alternativa modeller för säkerhets screening av kemiska föreningar3. Därför, i den tidiga fasen av läkemedelsutveckling, det skulle vara mycket fördelaktigt att använda en metod som snabbt kan utvärdera säkerheten och toxiciteten av föreningarna i en lämplig modell. Det finns flera protokoll som har använts för toxicitet screening av kemiska föreningar med djur-och cellkulturer kultur modeller men det finns inte ett enda protokoll som är validerade och är i allmänt bruk4,5. Befintliga protokoll som använder zebrafiskar varierar i längd och har använts av enskilda forskare som utvärderat toxiciteten enligt deras bekvämlighets krav6,7,8,9, 10 , elva , 12.
Under den senaste tiden har zebrafiskar vuxit fram som en praktisk modell för utvärdering av toxiciteten hos kemiska föreningar under embryonal utveckling6,7. Zebrafiskar har många inbyggda fördelar för utvärderingen av kemiska föreningar13. Även storskaliga experiment är mottagliga, som en zebrafiskar hona kan lägga partier av 200-300 ägg, som utvecklas snabbt ex vivo, behöver inte extern matning i upp till en vecka och är transparenta. Föreningarna kan tillsättas direkt i vattnet, där de kan (beroende på vilken typ av förening) diffus genom chorion, och efter kläckning, genom huden, gälar och munnen av larver. Experimenten kräver inte kopiösa mängder av kemiska föreningar14 på grund av den lilla storleken på embryot. Utveckla zebrafiskar embryon uttrycka de flesta av de proteiner som krävs för att uppnå det normala utvecklings utfall. Därför är en zebrafiskar embryo en känslig modell för att bedöma om en potentiell drog kan störa funktionen av ett protein eller signalering molekyl som är utvecklingsmässigt betydande. Zebrafiskar organ blir funktionella mellan 2-5 DPF15, och föreningar som är giftiga under denna känsliga period av embryonal utveckling inducera fenotypiska defekter i zebrafiskar larver. Dessa fenotypiska förändringar kan lätt detekteras med hjälp av ett enkelt Mikroskop utan invasiva tekniker11. Zebrafish embryon används ofta i toxikologisk forskning på grund av deras mycket större biologiska komplexitet jämfört med in vitro -Drug screening med hjälp av cellkultur modeller16,17. Som ryggradsdjur är den genetiska och fysiologiska makeupen hos zebrafiskar jämförbar med människan, och därför är toxiciteter av kemiska föreningar likartade mellan zebrafiskar och människor8,18,19, 20 , 21 , 22. Zebrafish är således ett värdefullt verktyg i den tidiga fasen av läkemedels upptäckt för utvärdering av toxiciteten och säkerheten hos de kemiska föreningarna.
I den här artikeln, ger vi en detaljerad beskrivning av den metod som används för att utvärdera säkerheten och toxiciteten av karbanhydras (ca) hämmare föreningar med 1-5-dagars post fertilisering (DPF) zebrafiskar embryon av en enda forskare. Protokollet omfattar att exponera zebrafiskar embryon för olika koncentrationer av kemiska hämmare föreningar och studera dödlighet och fenotypiska förändringar under embryonal utveckling. Vid slutet av exponeringen för kemiska föreningar, LC50 dosen av kemikalien bestäms. Metoden gör det möjligt för en individ att utföra effektiv screening av 1-5 test föreningar och tar ca 8-10 h beroende på erfarenheten av den person med metoden (figur 1). Var och en av de steg som krävs för att bedöma toxiciteten av föreningarna beskrivs i figur 2. Utvärderingen av toxicitet av CA-hämmare kräver 8 dagar, och inkluderar inrättande av parning par (dag 1); insamling av embryon från avels tankar, rengöring och förflyttning av dem till inkubator för 28,5 ° c (dag 2). spridningen av embryona till brunnarna i en 24-brunnsplatta och tillsats av utspädda CA-hämmare (dag 3). fenotypisk analys och avbildning av larver (dag 4-8), och bestämning av LC50 -dos (day8). Denna metod är snabb och effektiv, kräver en liten mängd av den kemiska föreningen och endast grundläggande anläggningar av laboratoriet.
In vitro toxicitetstest med odlade celler kan detektera överlevnad och morfologiska studier av cellerna som ger begränsad information om toxiciteten som induceras av testsubstansen. Fördelen med toxicitet screening av kemiska föreningar med hjälp av zebrafiskar embryon är snabb detektion av kemiskt inducerade fenotypiska förändringar i ett helt djur under embryonal utveckling i en relevant modellorganism. Cirka 70% av de protein-kodning mänskliga gener har ortologgar motsvarigheter i zebrafiskar Genome<…
The authors have nothing to disclose.
Verket stöddes av bidrag från Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), Finlands Kulturstiftelse (AA, MH), Finlands Akademi (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tammerfors Tuberkulosstiftelse (SP, MH och MP) samt Jane och Aatos Erkkos stiftelse (SP och MP ). Vi tackar våra italienska och franska medarbetare, Prof. Supuran, och prof. Winum, för att tillhandahålla karbanhydrashämmare för säkerhet och toxicitet utvärdering för anti-TB och anti-cancerläkemedel utvecklingsändamål. Vi tackar Aulikki Lehmus och Marianne Kuuslahti för det tekniska biståndet. Vi tackar också Leena Mäkinen och Hannaleena Piippo för deras hjälp med sebrafiskuppfödning och insamling av embryon. Vi tackar uppriktigt Harlan Barker för kritisk utvärdering av manuskriptet och insiktsfulla kommentarer.
24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |