שמירת עבודה והמשך המגע הכוח איתות פרוטוקול המסך מוטציה למחקר של Thigmomorphogenesis של צמח המודל Arabidopsis thaliana
Summary
מכונת העמסה עדינה של כוח מגע בנויה ממברשות שיער אנושיות, זרועות רובוטיות ובקר. מברשות השיער מונעים על ידי זרועות רובוטיות המותקנות במחשב ולנוע מעת לעת כדי להחיל כוח מגע על צמחים. החוזק של נגיעות שיער מונחה מכונה דומה לזה של נגיעות שהוחלו ידנית.
Abstract
הצמחים מגיבים הן לגירוי מכני התאיים והן לחילוץ (או אותות כוח) ולפתח שינויים מורפולוגיים מיוחדים, שנקרא thigmomorphogenesis. בעשורים האחרונים זוהו מספר מרכיבי איתות ודווחו על היותם מעורבים במטיית המכונה (למשל, מחייב סידן, חלבונים ואנזימים ביולוגיים). עם זאת, הקצב האיטי יחסית של מחקר במחקר של כוח איתות או thigmomorphogenesis מיוחס במידה רבה לשתי סיבות: הדרישה של מפרך יד האדם מניפולציה אינדוקציה מגע של thigmomorphogenesis ואת הכוח שגיאות כוח שקשורים למגע יד של אנשים. כדי לשפר את יעילות הטעינה של כוח חיצוני על אורגניזם צמח, נבנתה מכונת טעינה אוטומטית של כוח מגע. זה רובוטית זרוע מונחה שיער נגיעות לספק הדמיה העבודה בקלות לשחזור הדמיית כוח, סיבובים ללא הגבלה של חזרה מגע וחוזק מגע מתכווננת. זה שיער מגע כוח מכונת טעינה ניתן להשתמש הן עבור הקרנת בקנה מידה גדול של כוח מגע מוטציות איתות והמחקר phenomics של הצמח thigmomorphogenesis. בנוסף, חומרי מגע כגון שיער אנושי, ניתן להחליף עם חומרים טבעיים אחרים כמו שיער בעלי חיים, חוטי משי וסיבי כותנה. הזרועות נע אוטומטית על המחשב עשוי להיות מצויד עם חרירי המים ומפוחים אוויר כדי לחקות את הכוחות הטבעיים של טיפות גשם ורוח, בהתאמה. על ידי שימוש אוטומטי זה שיער מגע כוח מכונת טעינה בשילוב עם ביצוע ביד ספוגית כותנה לגעת, חקרנו את תגובת המגע של שני כוח מוטציות איתות, MAP kinase kinase 1 (MKK1) ו MKK2 צמחים . Phenomes של כוח מגע טעון צמחים סוג פראי ושני מוטציות הוערכו סטטיסטית. הם הציגו הבדלים משמעותיים בתגובת המגע.
Introduction
מפעל הצמחים הוא מונח שנטבע על ידי יפה, MJ ב 19731. זהו הטרוריזם של הצמח אך שונה מפוטוטרוזם הידוע או מגרביטיות הנגרמת על ידי גירויים של אור השמש או כוח הכבידה2,3. היא מתארת שינויים פנוטיוריים הקשורים בגירוי מכני תקופתי, אשר נצפו לעתים קרובות על ידי וטניקאים בזמנים קדומים יותר4,5. טיפות גשם, רוח, צמח, בעלי חיים ונגיעות אנושיות, אפילו נשיכות בעלי חיים, נחשבים כולם לסוגים שונים של גירויים שמפעילים את איתות הכוח בצמחים4,5. מאפייני הצמח thigmomorphogenesis כוללים את עיכוב בולטינג, גזע קצר יותר, שושנת עלים קטנים יותר/עלה בצמחים עשבוני, וגבעול עבה יותר צמחים וודי6,7,8. זה בניגוד לתגובה התנזירים או thigmoטרופי לעתים קרובות נמצא במפעל Mimosa או אחרים מכונאי רגיש גפנים, שם אלה התגובות מגע מהיר קל יותר להיות נצפתה1,9,10. מאידך, לעומת זאת, קשה יחסית להבחין בגלל תגובת הגדילה האיטית שלו. Thigmomorphogenesis הוא בדרך כלל נצפתה בעקבות שבועות או אפילו שנים של גירוי מתמשך כוח העמסה. זה הטבע הייחודי של התגובה למגע הצמח מקשה לבצע מסך גנטי קדימה באמצעות גירוי מגע יד האדם כדי לבודד את מוטציות כוח המגע איתות עמיד בצורה איתנה.
כדי להבהיר את משעולים אותות הכוח ואת המנגנונים המולקולריים המשמשים את הניסויים הביולוגיים של thigmomorphogenesis6,11, ביולוגיים מולקולריים וסלולריים בוצעו בעבר6, .12,13,14 מחקרים אלה הציעו כי כוח הצמח קולטני האות מורכב בעיקר של ערוצי יון מכונאי (MSC) ואת מתחמי הקשור MSC מורכב על ידי מכלולי מולטימאריק של חלבונים המשתרעים על ידי ממברנות11,14 , 15. בתוך שניות של המגע הראשוני cytoplasmic2 + ספייק חולף. רוח-, גשם, או gravi-גירוי יכול לתקשר עם חיישני הסידן במורד הזרם כדי לשדר את אותות הכוח לאירועים גרעיניים14,16,17,18. בנוסף למחקרים מולקולריים וסלולריים, המסך הגנטי קדימה עם נגיעה ידנית של צמחים מצא כי פיטוהורמונים מטבוליטים משני מעורבים בביטוי הגנטי הסוגר inducible (TCH) בעקבות ה . כוח מגע מעמיס13,19 לדוגמה, aos ו- opr320 מוטציות זוהו עד כה ממחקרים גנטיים. עם זאת, הבעיה העיקרית הקשורה ליישום של גנטיקה קדימה במחקר של thigmomorphogenesis היא עדיין עבודה אינטנסיבית הנדרשת לכמת את רמת התגובה מגע ונגיעה באוכלוסייה גדולה של מוטציה גנטית צמחים בודדים. בעיה גוזלת זמן גם ממשיכה לגעת במסך מוטציה מבוסס יד14,20. לדוגמה, כדי להשלים סבב אחד של גירוי בכוח מגע, אדם צריך לגעת 30-60 פעמים (נגיעה אחת לשניה) על צמח בודד. כדי לקבל מספיק מספר צמחים עבור ניתוח הפנוטיפ סטטיסטית, 20-50 צמחים בודדים של ה-גנוטיפ זהה נדרשים בדרך כלל עבור תהליך הטעינה כוח המגע. זה משטר מגע כוח הטעינה משמעו כי אדם צריך לבצע שוב ושוב באופן מידי ביצוע של 600-3000 נגיעות על גנוטיפ אחד של בחירה. סוג זה של מגע בדרך כלל צריך לחזור 3 כדי 5 סיבובים ביום, אשר שווה בערך 1800-15000 אצבע או כותנה לגעת ספוגית ליום לכל גנוטיפ של צמחים. אדם מיומן היטב נדרש בדרך כלל כדי לשמור על הכוח והכוח של נגיעות מרובות בתוך טווח רצוי לאורך סיבובים רבים של חזרות ביום כדי למנוע וריאציה גדולה כוח וכוח. כפי שהוא ידוע היטב כי thigmomorphogenesis הוא תהליך תלוי ומינון במינון6,21, כוח מגע/כוח הופך קריטי להצלחה מפעילה תגובת מגע של צמח.
כדי להסיר את הטעינה תלוי אדם בכוח המגע וכלה לשמור על יישום מכני בתוך טווח שגיאה מקובל14, ולכן עיצבנו מכונת מגע אוטומטי בכוח הטעינה כדי להחליף את הנגיעות ביד מניפולציה. המכונה 4 זרועות נעות בנוי, כל אחד מהם מצויד מברשת שיער אנושית אחת. גירסה זו נקראת דגם K1 כדי לציין את תכונת הטעינה של כוח מגע השיער האנושי. אם 4 גנוטיפים נמדדים ככמת עבור thigmomorphogenesis שלהם או תגובת מגע תחת אחד המכונה, 40-48 אנשים לכל גנוטיפ ניתן למדוד. כל סיבוב של חזרה מגע (פחות מ 60 פעמים של מגע לכל צמח) נמשך פחות מ 5 דקות באמצעות זרוע רובוטית מתכווננת מהירות הנעה. כך, צמחים על מכונת מודל K1 touch יכול להיות מגורה מכנית עבור סיבובים מרובים ביום או עם מתמדת כוח מגע טעינה או רמות שונות של חוזק כמו מתוכנתים בתחילה.
Arabidopsis thaliana, מודל האורגניזם צמח, ולכן נבחר מינים צמח היעד לבדיקת שיער אוטומטי מלאה כוח המגע המחשב טעינת יישום. כי יש כמה בנקים גדולים זרעים זמינים לאחזור germפלסטיות שונים של מוטציות בגודל של פריחה, Arabidopsis מתאים גם לחלל הזמין במדף הצמיחה רכוב עם מכונת המגע דגם K1.
מכונת המגע האוטומטית דגם K1 מורכבת משלושה רכיבים עיקריים: (1) מתלה המתכת של ה-H-shape מורכב משני מפעילים ליניאריים מונחי-חגורה, (2) זרועות מתכת רובוטיות מצוידות במברשות שיער, ו (3) בקר. עבור מכונת מגע K1 דגם מותאם אישית, כל מודול X/Y ציר מורכב מדריך אחד חגורה מונחה-מסילות, שני גושי שקופיות (אדום) ו-1 57 stepper מנוע (מותקן מראש ומנותק) (איור 1א,ב). המפעיל האופקי העליון מאפשר זרוע מתכת רובוטית לנוע שמאלה וימינה אופקית, המפעיל האנכי התחתון מונחה חגורה ליניארי מאפשר זרוע מתכת רובוטית לנוע אנכית למעלה ולמטה (איור 1B, איור 2A ). ארבעה זרועות רובוטיות שאינן מותקנות הותקנו על המפעיל האנכי (איור 1ג, איור 2ב’). ארבע מברשות שיער אנושיות היו קשורות ארבע זרועות רובוטיות, בהתאמה (איור 1ג, איור 2ב). כל חלקי מכני כדי לבנות את מכונת K1 touch מודל בגופן מודגש להלן מסומנים באיור 1ג (גם לראות את הטבלה של חומרים).
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis היא תגובה צמיחה מורכבת הצמח לקראת רטבאליות מכני, אשר מערבת רשת של איתות סלולרי פעולה של פיטוהורמונים. זוהי תוצאה של האבולוציה מסתגלת של צמחים לשרוד תחת תנאים סביבתיים לא רצויים25,26. מגע מכני, בעיקר מגע הגוף האנושי ביד כותנה לגעת ספוגית, נבחרו ללמוד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי המענקים הבאים: 31370315, 31570187, 31870231 (הקרן הלאומית המדע של סין), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC של הונג קונג). מחברים רוצים להודות Ju פנג דיוק ואוטומציה טכנולוגיה מוגבלת (שנג, סין) עבור ההנפקה שלהם מספר תרשימים המוצגים באיור 1.
מחברים גם רוצים להודות ש. ק. צ’אנג וג. לי על תרומתם לפיתוח מכונת ההעמסה של כוח המגע.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. . The Flowering Process. , (1963).
- Darwin, C. . The Power of Movement in Plants. , (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
