Ein arbeitssparendes und wiederholbares Touch-Force Signaling Mutant Screen Protocol zur Untersuchung der Thigmomorphogenese einer Modellpflanze Arabidopsis thaliana
Summary
Eine sanfte Touch-Force-Lademaschine wird aus menschlichen Haarbürsten, Roboterarmen und einem Controller gebaut. Die Haarbürsten werden von Roboterarmen angetrieben, die auf der Maschine installiert sind, und bewegen sich periodisch, um Berührungskraft auf Pflanzen anzuwenden. Die Stärke maschinengetriebener Haarberührungen ist vergleichbar mit der von manuell aufgetragenen Berührungen.
Abstract
Pflanzen reagieren sowohl auf intrazelluläre als auch auf extrazelluläre mechanische Stimulationen (oder Kraftsignale) und entwickeln spezielle morphologische Veränderungen, eine sogenannte Thigmomorphogenese. In den vergangenen Jahrzehnten wurden mehrere Signalkomponenten identifiziert und berichtet, dass sie an der Mechanotransduktion beteiligt waren (z. B. Calciumionenbindungsproteine und Jasmonsäure-Biosyntheseenzyme). Das relativ langsame Forschungstempo bei der Untersuchung von Kraftsignalisierung oder Thigmomorphogenese wird jedoch weitgehend auf zwei Gründe zurückgeführt: die Forderung nach mühsamer, von Hand bearbeiteter Berührungsinduktion der Thigmomorphogenese und der Kraftstärkefehler. mit der Handberührung der Menschen verbunden sind. Um die Effizienz der externen Kraftbelastung eines Pflanzenorganismus zu erhöhen, wurde eine automatische Touch-Force-Lademaschine gebaut. Diese roboterarme Haarbürste sorgt für eine arbeitssparende und leicht wiederholbare Touch-Force-Simulation, unbegrenzte Touch-Wiederholungsrunden und einstellbare Berührungsstärke. Diese Haar-Touch-Kraft-Lademaschine kann sowohl für großflächige Screening von Touch-Force-Signalmutanten als auch für die Phänomik-Studie der Pflanzenthigmomorphogenese verwendet werden. Darüber hinaus können Touch-Materialien wie menschliches Haar durch andere natürliche Materialien wie Tierhaare, Seidenfäden und Baumwollfasern ersetzt werden. Die automatisierten beweglichen Arme an der Maschine können mit Wassersprühdüsen und Luftgebläsen ausgestattet werden, um die natürlichen Kräfte von Regentropfen bzw. Wind nachzuahmen. Durch den Einsatz dieser automatischen Haar-Touch-Force-Lademaschine in Kombination mit dem handausgeführten Wattestäbchen-Touch-Touch-Touch haben wir die Berührungsverhalten zweier Kraftsignalmutanten, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) und MKK2-Anlagen, untersucht. . Die Phenome der touchforcegeladenen Wildpflanzen und zwei Mutanten wurden statistisch ausgewertet. Sie weisen erhebliche Unterschiede in der Berührungsverhalten auf.
Introduction
Pflanzenthigmomorphogenese ist ein Begriff, der von Jaffe, MJ im Jahr 19731geprägt wurde. Es ist eine Pflanzentropismus, aber anders als die bekannte Phototropismus oder Gravitropismus durch Reize des Sonnenlichts oder Schwerkraft verursacht2,3. Es beschreibt phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit periodischen mechanischen Stimulationen, die häufig von Botanisten in früheren Zeiten beobachtet wurden4,5. Regentropfen, Wind, Pflanzen, Tier- und Menschliche Berührungen, sogar Tierbisse, gelten alle als verschiedene Arten von Mechano-Stimuli, die die Kraftsignalisierung in Pflanzenauslösen 4,5. Zu den Merkmalen der Pflanzenthigmomorphogenese gehören die Verzögerung der Verschraubung, ein kürzerer Stamm, eine kleinere Rosette/Blattgröße in krautigen Pflanzen und dickerer Stamm in holzigen Pflanzen6,7,8. Dies ist im Gegensatz zu der thigmonastischen oder thigmotropen Reaktion, die oft in der Mimosa-Pflanze oder anderen mechanoempfindlichen Reben gefunden wird, wo diese schnellen Berührungsreaktionen leichter beobachtet werden können1,9,10. Thigmomorphogenese hingegen ist aufgrund ihrer langsamen Wachstumsreaktion relativ schwer zu beobachten. Die Thigmomorphogenese wird in der Regel nach Wochen oder sogar Jahren kontinuierlicher Kraftbelastungsstimulation beobachtet. Diese einzigartige Natur der Reaktion auf die Reaktion auf die Pflanzliche Berührung macht es schwierig, einen vorwärtsgerichteten genetischen Bildschirm mit menschlicher Handberührungsstimulation durchzuführen, um die Berührungskraft signalisierenden resistenten Mutanten auf robuste Weise zu isolieren.
Zur Aufklärung der Kraftsignaltransduktionswege und der molekularen Mechanismen, die der Thigmomorphogenese zugrunde liegen, wurdeninden letzten6 , 12,13,14. Diese Studien haben vorgeschlagen, dass die Pflanzenkraftsignalrezeptoren hauptsächlich aus mechanosensitiven Ionenkanälen (MSC) und den gebundenen MSC-Komplexen bestehen, die aus multimerischen Komplexen membranübergreifender Proteinebestehen 11,14 , 15. Die zytoplasmatische Ca2+ transiente Spitze erzeugt innerhalb von Sekunden nach der ersten Berührung. Wind-, Regen- oder Gravistimulation kann mit den nachgeschalteten Kalziumsensoren interagieren, um die Kraftsignale auf nukleare Ereignisse zu transduzieren14,16,17,18. Neben molekularen und zellulären Studien hat der vorwärtsgenetische Bildschirm mit manueller Fingerberührung von Pflanzen festgestellt, dass Phytohormone und die sekundären Metaboliten an der daraus resultierenden Berührungs-induzierbaren (TCH) Genexpression nach dem Touch-Force-Belastung13,19. Zum Beispiel wurden aos und opr320 Mutanten bisher weit von den genetischen Studien identifiziert. Das Hauptproblem, das mit der Anwendung der Vorwärtsgenetik bei der Untersuchung der Thigmomorphogenese verbunden ist, ist jedoch nach wie vor die intensive Arbeit, die erforderlich ist, um das Niveau der Berührungsreaktion zu quantitieren und eine große Population genetisch mutierter einzelnen Pflanzen. Das zeitaufwändige Problem besteht auch im handberührenden Mutantbildschirm14,20. Um beispielsweise eine Runde der Berührungskraftstimulation abzuschließen, muss eine Person 30-60 Mal (eine Berührung pro Sekunde) an einer einzelnen Pflanze berühren. Um genügend Pflanzen für die statistische Phänotypanalyse zu haben, werden normalerweise 20-50 Einzelpflanzen desselben Genotyps für den Touch-Kraft-Ladevorgang benötigt. Dieses Touch-Force-Laderegime bedeutet, dass eine Person wiederholt 600-3.000 Berührungen auf einem Genotyp der Wahl durchführen muss. Diese Art der Berührung muss normalerweise 3 bis 5 Runden pro Tag wiederholt werden, was etwa 1.800-15.000 Finger- oder Wattestäbchen-Berührungen pro Tag pro Pflanzengeganz entspricht. Eine gut ausgebildete Person ist normalerweise erforderlich, um die Kraft und Kraft von mehreren Berührungen innerhalb eines wünschenswerten Bereichs in vielen Wiederholungsrunden an einem Tag zu halten, um die große Variation in Kraft und Stärke zu vermeiden. Da bekannt ist, dass thigmomorphogenese ein sättigungsfähiger und dosisabhängiger Prozess ist6,21, wird Berührungskraft/Stärke entscheidend für einen Erfolg bei der Auslösung der Berührungsreaktion einer Pflanze.
Um die personenabhängige Berührungskraftbelastung zu entfernen und die mechanische Anwendung innerhalb eines akzeptablen Fehlerbereichs14zu erhalten, haben wir daher eine automatische Touchforce-Lademaschine entwickelt, um die handmanipulierten Berührungen zu ersetzen. Die Maschine hat 4 bewegliche Arme gebaut, von denen jeder mit einer menschlichen Haarbürste ausgestattet ist. Diese Version heißt Model K1, um seine Funktion der menschlichen Haar-Touch-Force-Belastung anzugeben. Wenn 4 Genotypen quantitativ auf ihre Thigmomorphogenese oder Berührungsreaktion unter einer Maschine gemessen werden, können 40-48 Individuen pro Genotyp gemessen werden. Jede Touch-Wiederholungsrunde (weniger als 60 Mal Touch pro Pflanze) dauert weniger als 5 Minuten mit einem mit einer Geschwindigkeit einstellbaren Roboterarm. So können Anlagen einer Touch-Maschine des Typs K1 für mehrere Runden pro Tag mechanisch stimuliert werden, entweder mit einer konstanten Touch-Kraft-Belastung oder unterschiedlichen Stärken, wie zunächst programmiert.
Arabidopsis thaliana, ein Modellpflanzenorganismus, wurde daher als Zielpflanzenart für die Prüfung der vollautomatischen Haar-Touch-Force-Lademaschine ausgewählt. Da es mehrere große Saatbänke gibt, um die verschiedenen Keimplasmen von Mutanten und die Größe der Blüte zu bergen, passt Arabidopsis gut zu dem Platz, der im Wachstumsregal mit der Touch-Maschine Model K1 montiert ist.
Die automatische Touch-Maschine des Typs K1 besteht aus drei Hauptkomponenten: (1) dem H-förmigen Metallgestell aus zwei riemengetriebenen Linearantrieben, (2) Roboter-Metallarmen mit Haarbürsten und (3) einem Controller. Bei einer kundenspezifischen Touch-Maschine des Modells K1 besteht jedes X/Y-Achsenmodul aus einer riemengetriebenen Führungsschiene, zwei Gleitblöcken (rot) und einem 57 Schrittmotor (vorinstalliert und demontierbar) (Abbildung1A,B). Der obere horizontale Aktuator ermöglicht es dem Roboter-Metallarm, sich horizontal nach links und rechts zu bewegen, der untere vertikale, riemengetriebene Linearantrieb ermöglicht es dem Roboter-Metallarm, sich vertikal nach oben und unten zu bewegen (Abbildung 1B, Abbildung 2A ). Auf dem vertikalen Aktuator wurden vier abnehmbare Roboterarme installiert (Abbildung 1C, Abbildung 2B). Vier menschliche Haarbürsten waren an vier Roboterarme gebunden (Abbildung 1C, Abbildung 2B). Alle mechanischen Teile, um die Touch-Maschine Model K1 in fett gedruckter Schrift zu konstruieren, sind in Abbildung 1C (siehe Tabelle der Materialien) gekennzeichnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenese ist eine komplexe Reaktion auf mechanische Störungen, die ein Netzwerk von zellulärer Signalisierung und Wirkung von Phytohormonen beinhaltet. Es ist eine Folge der adaptiven Evolution der Pflanzen, um unter den unerwünschten Umweltbedingungen zu überleben25,26. Mechanische Berührung, vor allem menschliche Fingerberührung und handgehaltene Wattestäbchen Berührung, wurden ausgewählt, um diese morphologischen Veränderungen in zuvor thig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch folgende Stipendien unterstützt: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC von Hongkong). Die Autoren danken Ju Feng Precision and Automation Technology Limited (Shenzhen, China) für ihr Angebot mehrerer Schaltpläne, die in Abbildung 1dargestellt sind.
Die Autoren danken auch S. K. Cheung und W. C. Lee für ihren Beitrag zur Entwicklung der Touch-Force-Lademaschine.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
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