Bir model tesisi Arabidopsis thaliana Thigmomorphogenesis çalışması Için bir işgücü tasarrufu ve tekrarlanabilen dokunma-Force sinyalizasyon mutant ekran Protokolü
Summary
Nazik bir dokunma kuvveti yükleme makinesi insan saç fırçaları, robotik kollar ve bir kumandanın inşa edilmiştir. Saç fırçaları makineye monte edilen robotik kollar tarafından tahrik edilir ve bitkiler üzerinde dokunmatik kuvvet uygulamak için periyodik olarak hareket ederler. Makine odaklı saç dokunuşlarının gücü, manuel olarak uygulanan dokunuşlarla karşılaştırılabilir.
Abstract
Bitkiler hem hücre içi hem de hücre dışı mekanik stimülasyon (veya kuvvet sinyalleri) yanıt ve özel morfolojik değişiklikler, denilen bir thigmomorphogenesis geliştirmek. Geçtiğimiz yıllarda, birkaç sinyal bileşenleri tespit edilmiş ve mechanotransdution dahil olmak üzere bildirilen (örneğin, kalsiyum iyon bağlayıcı proteinler ve jasmonik asit biyosentez enzimleri). Ancak, kuvvet sinyalizasyon veya thigmomorphogenesis çalışmada araştırmanın nispeten yavaş hızı büyük ölçüde iki nedenden dolayı atfedilir: thigmomorphogenesis ve kuvvet gücü hataları zahmetli insan el manipüle dokunmatik indüksiyon için gereksinimi insanların el dokunma ile ilişkili. Bir bitki organizmasında dış kuvvet yükleme verimliliğini artırmak için, otomatik bir dokunmatik kuvvet yükleme makinesi inşa edilmiştir. Bu robotik kol odaklı saç fırçası dokunuşları, işgücü tasarrufu ve kolayca tekrarlanabilen dokunmatik kuvvet simülasyonu, sınırsız sayıda dokunma tekrarlama ve ayarlanabilir dokunmatik mukavemeti sağlar. Bu saç dokunma-kuvvet yükleme makinesi dokunmatik kuvvet sinyalizasyon mutantlar ve bitki thigmomorphogenesis phenomics çalışma hem büyük ölçekli tarama için kullanılabilir. Buna ek olarak, insan saçı gibi dokunma malzemeleri, hayvan saçı, ipek ipliği ve pamuk lifleri gibi diğer doğal malzemelerle değiştirilebilir. Makinede otomatik hareket eden kollar, sırasıyla yağmur damlaları ve rüzgarın doğal kuvvetlerini taklit etmek için su yağmurlama memeleri ve hava Blower ile donatılmış olabilir. Bu otomatik saç dokunma-kuvvet yükleme makinesini elle gerçekleştirilen pamuk çubuklu dokunuşuyla birlikte kullanarak, iki kuvvet sinyalizasyon mutantların dokunmatik yanıtı araştırdık, MAP kınase KINASE 1 (MKK1) ve MKK2 tesisleri . Dokunmatik kuvvet yüklü vahşi tip bitkiler ve iki mutantların phenomes istatistiksel olarak değerlendirildi. Onlar dokunma yanıtı önemli farklılıklar sergilediler.
Introduction
Bitki thigmomorphogenesis Jaffe tarafından icat edildi bir terim, MJ 19731. Bu bir bitki tropism ama iyi bilinen fototropism veya çekim ışığı veya yerçekimi uyaranlara neden gravitropizm farklı2,3. Bu periyodik mekanik stimülasyon ile ilişkili fenotipik değişiklikler açıklar, hangi sıklıkla botanikçiler tarafından önceki zamanlarda gözlenen olmuştur4,5. Yağmur damlaları, Rüzgar, bitki, hayvan ve insan dokunuşları, hatta hayvan ısırıkları, tüm bitkiler4,5sinyalizasyon kuvvet tetikleyici mechano-uyaran farklı türleri olarak kabul edilir. Bitki thigmomorphogenesis özellikleri bolting gecikme, daha kısa bir kök, Otsu bitkiler küçük rozet/yaprak boyutu ve Woody bitkiler6,7,8kalın kök içerir. Bu tigmonastic veya thigmotropic yanıt genellikle Mimoza bitki veya diğer mekanik duyarlı Vines bulunan aksine, bu hızlı dokunma tepkiler daha kolay gözlenen1,9,10. Diğer taraftan thigmomorphogenesis, yavaş büyüme tepkisi nedeniyle gözlemlenmesi nispeten zordur. Thigmomorphogenesis genellikle haftalar veya hatta yıl sürekli kuvvet yükleme stimülasyon takip görülür. Bitki dokunma tepkisi bu eşsiz doğası güçlü bir şekilde dokunmatik kuvvet sinyalizasyon dayanıklı mutantlar izole etmek için insan el dokunma stimülasyon kullanarak ileri genetik ekran gerçekleştirmek için yapar.
Son6 ‘ da kuvvet sinyal dönüştürücülerinin ve thigmomorphogenesis 6, 11, moleküler ve hücresel biyolojik deneylerin temelindeki moleküler mekanizmaların yapılmasının 12,13,14. Bu çalışmalar, bitki kuvveti sinyal reseptörlerinin özellikle mekanik duyarlı iyon kanalları (msc) ve membran yayılma proteinleri multimeric kompleksleri tarafından oluşan gergin msc kompleksleri oluşur önerdi11,14 , 15. ilk dokunuşla saniye içinde oluşturulan sitoplazmik CA2 + geçici başak. Rüzgar, yağmur, ya da gravi-stimulasyon nükleer olaylara kuvvet sinyalleri geçiş için aşağı kalsiyum sensörleri ile etkileşime girebilir14,16,17,18. Moleküler ve hücresel çalışmalara ek olarak, bitkilerin manuel parmak dokunmadan ileri genetik ekran fitohormonlar ve İkincil metabolitler sonucu dokunma indüklenebilir (TCH) gen ifadesi aşağıdaki dahil olduğunu buldu Touch-Force yükleme13,19. Örnekler için, AOS ve opr320 mutantlar genetik çalışmalarda şimdiye kadar tespit edilmiştir. Ancak, thigmomorphogenesis çalışmada ileri genetik uygulama ile ilgili önemli sorun hala yoğun işgücü dokunmatik yanıt seviyesini quantitating ve genetik mutasyona uğramış büyük bir nüfus dokunmadan için gerekli bireysel bitkiler. Zaman alan sorun da el dokunmadan tabanlı mutant ekran14,20devam ediyor. Bir örnek için, bir dokunma kuvveti stimülasyon bir tur tamamlamak için, bir kişinin tek bir bitki üzerinde 30-60 kez (saniyede bir dokunuş) dokunmak gerekir. İstatistiksel fenotip analizi için yeterli sayıda bitki olması için, 20-50 aynı genotipteki bireysel bitkiler normalde dokunma kuvveti yükleme işlemi için gereklidir. Bu dokunma kuvveti yükleme rejimi, bir kişinin bir genotipi tercih üzerine sürekli olarak 600-3000 dokunuşları gerçekleştirmesi gerektiği anlamına gelir. Dokunmatik bu tür normalde 3 ila 5 mermi bir gün, hangi yaklaşık 1800-15000 parmak veya bitki genotip başına gün başına pamuk çubukla dokunuşlar eşittir tekrarlanan gerekir. İyi eğitimli bir kişi normalde güç ve kuvvet ve güç büyük varyasyonu önlemek için bir gün içinde tekrarlama birçok tur boyunca arzu edilen bir Aralık içinde birden fazla dokunuşların gücünü korumak için gereklidir. Bu thigmomorphogenesis bir doyurabilir ve doza bağlı bir süreç6,21, dokunmatik kuvvet/mukavemet bir bitkinin dokunma tepkisi tetikleme başarı için kritik olur bilinmektedir.
Kişiye bağlı dokunmatik kuvvet yüklemesini kaldırmak ve kabul edilebilir bir hata aralığı14içinde mekanik uygulama korumak için, bu nedenle El manipüle dokunuşları yerine otomatik bir dokunmatik kuvvet yükleme makinesi tasarladık. Makine, her biri bir insan saç fırçası ile donatılmıştır inşa 4 hareketli kollar vardır. Bu sürüm, insan saç dokunma kuvveti yükleme özelliğini belirtmek için model K1 olarak adlandırılır. Eğer 4 genotip bir makine altında thigmomorphogenesis veya dokunma tepkisi için nicel olarak ölçüldüğünde, 40-48 genotip başına kişi ölçülebilir. Dokunma tekrarı her turda (daha az 60 bitki başına dokunma kez) hareketli bir hız ayarlanabilir robotik kol kullanarak 5 dakikadan az sürer. Böylece, bir model K1 dokunmatik makine üzerinde bitkiler mekanik olarak birden fazla tur için bir gün ya sabit bir dokunuş-Force yükleme veya başlangıçta programlanmış olarak güçlü farklı düzeylerde uyarılabilir.
Arabidopsis thaliana, bir model bitki organizma, bu nedenle tam otomatik saç dokunmatik kuvvet yükleme makinesi uygulaması test etmek için hedef bitki türleri olarak seçildi. Birçok büyük fide mutantlar ve çiçekli büyüklüğü çeşitli germplazmlar almak için kullanılabilir olduğundan, Arabidopsis model K1 dokunmatik makine ile monte edilen büyüme raf mevcut alana iyi uyuyor.
Model K1 otomatik dokunmatik makine üç ana bileşenden oluşur: (1) iki kemer tahrikli Doğrusal aktüatörler tarafından oluşturulan H-Shape metal raf, (2) saç fırçaları ile donatılmış robotik metal kollar, ve (3) bir denetleyici. Özelleştirilmiş bir model K1 dokunmatik makine için, her X/Y ekseni modülü bir kemer odaklı kılavuz raylı oluşur, iki Slayt blokları (kırmızı) ve 1 57 Step motor (önceden monte ve sökülebilir) (Şekil 1a,B). Üst yatay aktüatör, robotik metal kolun sol ve sağ yatay hareket etmesini sağlar, alt dikey kemer odaklı doğrusal aktüatör robotik metal kolun dikey olarak yukarı ve aşağı hareket etmesini sağlar (Şekil 1B, Şekil 2A ). Dikey aktüatörde dört adet sökülebilir robotik silah kuruldu (Şekil 1C, Şekil 2B). Dört insan saç fırçaları sırasıyla dört robotik kollara bağlı (Şekil 1C, Şekil 2B). Tüm mekanik parçalar model K1 dokunmatik makine inşa etmek için aşağıdaki kalın yazı tipi Şekil 1C (Ayrıca malzeme tablosunabakın) işaretlenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis mekanik perturbations doğru karmaşık bir bitki büyüme tepkisi, hangi hücresel sinyalizasyon ve phytohormonu eylem bir ağ içerir. Bu istenmeyen çevresel koşullar altında hayatta kalmak için bitkilerin adaptif evrim bir sonucudur25,26. Mekanik dokunuş, özellikle insan parmak dokunuşlu ve el-pamuk çubukla dokunuş, daha önce thigmomorphogenetic çalışmalar bu morfolojik değişiklikleri incelemek için seçildi<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada aşağıdaki hibe tarafından desteklenmektedir: 31370315, 31570187, 31870231 (Çin Ulusal Bilim Vakfı), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC Hong Kong). Yazarlar Şekil 1‘ de gösterilen çeşitli şemaları sunan Ju Feng Precision ve Automation Technology Limited (Shenzhen, Çin) teşekkür etmek istiyorum.
Yazarlar da Touch-Force yükleme makinesinin gelişimine katkıları için S. K. Cheung ve W. C. Lee teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. . The Flowering Process. , (1963).
- Darwin, C. . The Power of Movement in Plants. , (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
