بروتوكول شاشة إشارة متحولة لتوفير العمالة وتكرارها لدراسة الثيغمومورفولوجينيس لمصنع نموذجي أرابيدوبسيس ثاليانا
Summary
تم بناء آلة تحميل لطيفة تعمل باللمس من فرش الشعر البشري والأسلحة الروبوتية ووحدة تحكم. يتم دفع فرش الشعر بواسطة الأسلحة الروبوتية المثبتة على الجهاز وتتحرك بشكل دوري لتطبيق قوة اللمس على النباتات. قوة اللمسات الشعر يحركها آلة مماثلة لتلك التي من اللمسات المطبقة يدويا.
Abstract
النباتات التي تستجيب لكل من التحفيز اتّصال آليّ داخل أو خارج خلويّة (أو قوة إشارات) ويطوّر تغيرات خاصّة مورفولوجيّة, يدعى [ثيوغممورفولوجنسس]. في العقود الماضية، تم تحديد العديد من مكونات الإشارة والإبلاغ عن مشاركتها في الميكانوترانسدوكأيشن (على سبيل المثال، البروتينات الملزمة بأيون اتون الكالسيوم وإنزيمات التركيب الحيوي لحمض الجاسمونيك). ومع ذلك، فإن بطء نسبيا وتيرة البحوث في دراسة إشارات القوة أو التكومورفولوجيا تعزى إلى حد كبير إلى سببين: شرط الحث البشري التملّق باليد من الحث على الثيغمومورفوجينية وأخطاء قوة القوة المرتبطة بلمسة يد الناس. لتعزيز كفاءة تحميل القوة الخارجية على كائن نباتي، تم بناء آلة تحميل تلقائية تعمل باللمس. توفر هذه اللمسات الروبوتية لفرشاة الشعر التي تعمل بالذراع محاكاة تعمل باللمس قابلة للتكرار بسهولة، وجولات غير محدودة من التكرار باللمس وقوة اللمس القابلة للتعديل. ويمكن استخدام هذا الشعر قوة اللمس آلة التحميل لكل من فحص على نطاق واسع من المسوخ إشارة قوة اللمس ودراسة الفينوميكس من النباتات thigmomorphogenesis. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استبدال المواد التي تعمل باللمس مثل شعر الإنسان، مع مواد طبيعية أخرى مثل الشعر الحيواني، وخيوط الحرير وألياف القطن. ويمكن تجهيز الأسلحة المتحركة الآلي على الجهاز مع فوهات رش المياه والمنافيخ الهواء لتقليد القوى الطبيعية لقطرات المطر والرياح، على التوالي. باستخدام هذا الشعر التلقائي تعمل باللمس قوة آلة التحميل في تركيبة مع لمس مسحة القطن التي يتم تنفيذها يدويا، قمنا بالتحقيق في استجابة اللمس من اثنين من المسوخ إشارة القوة، MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) وMKK2 النباتات . قيّمت ال [فينومس] من ال [تووش-فورس] يحمّل وحشيّة نوع معامل واثنان مسوخ كان إحصائيّا. وقد أظهرت اختلافات كبيرة في الاستجابة اللمسية.
Introduction
مصنع thigmomorphogenes is هو المصطلح الذي صاغه جاف، MJ في عام 19731. بل هو التروبيسم النبات ولكن مختلفة عن فوتوتروبيسم المعروفة أو الجاذبية الناجمة عن محفزات أشعة الشمس أو الجاذبية2،3. وهو يصف التعديلات phenotypic المرتبطة التحفيز الميكانيكي الدوري، والتي لوحظت في كثير من الأحيان من قبل علماء النبات في أوقات سابقة4،5. قطرات المطر، والرياح، والنباتات، واللمسات الحيوانية والبشرية، وحتى لدغات الحيوانات، وتعتبر جميعها أنواع مختلفة من المحفزات المشانو التي تؤدي إلى قوة الإشارات في النباتات4،5. خصائص النباتات thigmomorphogenesis تشمل تأخير الاغلاق، والجذعية أقصر، أصغر وردية / ورقة حجم فيالنباتات العشبية، والجذعية سمكا في النباتات الخشبية 6،7،8. هذا هو على عكس استجابة thigmonastic أو thigmotropic غالبا ما توجد في نبات الميموزا أو غيرها من الكروم الحساسة الميكانو، حيث هذه الاستجابات التي تعمل باللمس السريع من الأسهل أن يلاحظ1،9،10. من ناحية أخرى، من الصعب نسبياً ملاحظة التكوّن من الثيوغموبومورفو بسبب استجابته البطيئة للنمو. عادة ما يلاحظ تكوين الثيوغمومورفو بعد أسابيع أو حتى سنوات من التحفيز المستمر لتحميل القوة. هذه الطبيعة الفريدة من استجابة لمسة النبات يجعل من الصعب إجراء شاشة وراثية إلى الأمام باستخدام تحفيز اللمس اليدوي البشري لعزل المتحولين المقاومين للقوة التي تعمل باللمس بطريقة قوية.
لتوضيح مسارات نقل إشارة القوة والآليات الجزيئية الكامنة وراء التكومورمورجينيسيس6،11، وقد أجريت التجارب البيولوجية الجزيئية والخلوية فيالماضي 6، 12،13،14. وقد اقترحت هذه الدراسات أن مستقبلات إشارة قوة النبات تتكون أساسا من قنوات أيون mechanosensitive (MSC) ومجمعات MSC المربوطة تتألف من مجمعات متعددة من البروتينات التي تمتد الغشاء11،14 , 15.السيتوبلازمية كا2+ ارتفاع عابر ولدت في غضون ثوان من لمسة أولية. الرياح، المطر، أو تحفيز الجاذبية قد تتفاعل مع أجهزة استشعار الكالسيوم المصب لنقل إشارات القوة إلى الأحداث النووية14،16،17،18. بالإضافة إلى الدراسات الجزيئية والخلوية، وجدت الشاشة الوراثية إلى الأمام مع لمس إصبع يدوي للنباتات أن الهرمونات النباتية والأيض الثانوي تشارك في التعبير الجيني الذي يترتب على ذلك اللمس (TCH) بعد لمس قوة التحميل13،19. على سبيل المثال، تم تحديد aos وopr320 متحولين حتى الآن من الدراسات الوراثية. ومع ذلك، فإن المشكلة الرئيسية المرتبطة بتطبيق علم الوراثة إلى الأمام في دراسة علم الجينات الثيغمومورفوجينية لا تزال العمل المكثف المطلوب لتكميم مستوى الاستجابة باللمس ولمس عدد كبير من السكان من المتحولين وراثيا النباتات الفردية. المسألة التي تستغرق وقتا طويلا لا تزال قائمة أيضا في اليد لمس القائم على شاشة متحولة14،20. على سبيل المثال، لإكمال جولة واحدة من التحفيز قوة اللمس، يحتاج الشخص إلى لمس 30-60 مرة (لمسة واحدة في الثانية) على مصنع فردي. من أجل الحصول على عدد كاف من النباتات لتحليل النمط الظاهري الإحصائي، هناك حاجة عادة إلى 20-50 من النباتات الفردية من نفس النمط الجيني لعملية تحميل قوة اللمس. يعني نظام تحميل قوة اللمس هذا أن الشخص يحتاج إلى إجراء 600-3000 لمسة على النمط الجيني واحد من الخيارات. هذا النوع من اللمس عادة ما يحتاج إلى تكرار 3 إلى 5 جولات في اليوم، وهو ما يعادل ما يقرب من 1800-15،000 الاصبع أو القطن مسحة اللمسات في اليوم الواحد لكل النمط الجيني من النباتات. وعادة ما يطلب من شخص مدرب تدريبا جيدا للحفاظ على قوة وقوة اللمسات المتعددة ضمن نطاق مرغوب فيه طوال العديد من جولات التكرار في يوم واحد لتجنب التباين الكبير في القوة والقوة. كما هو معروف جيدا أن التكومورفو التكوين هو عملية saturable والجرعة تعتمدعلى 6،21، قوة اللمس / قوة يصبح حاسما للنجاح في إثارة استجابة اللمس من النبات.
لإزالة تحميل قوة اللمس التي تعتمد على الشخص والحفاظ على التطبيق الميكانيكي ضمن نطاق خطأ مقبول14،لذلك قمنا بتصميم آلة تحميل التلقائي قوة اللمس لتحل محل اللمسات التي يتم التلاعب بها باليد. الجهاز لديه 4 الأسلحة المتحركة بنيت، وقد تم تجهيز كل منها مع فرشاة شعر الإنسان واحد. ويسمى هذا الإصدار نموذج K1 لتحديد ميزة من الشعر البشري تعمل باللمس قوة التحميل. إذا تم قياس 4 أنماط جينية كمياً لنشأة الثيغمومورفو أو الاستجابة باللمس تحت آلة واحدة، يمكن قياس 40-48 فردًا لكل نمط جيني. تستمر كل جولة من التكرار باللمس (أقل من 60 مرة من اللمس لكل مصنع) أقل من 5 دقائق باستخدام ذراع روبوتية قابلة للتعديل بسرعة متحركة. وهكذا، يمكن تحفيز النباتات على آلة اللمس K1 النموذجية ميكانيكيا لجولات متعددة في اليوم إما مع تحميل قوة اللمس المستمر أو مستويات مختلفة من نقاط القوة كما هو مبرمج في البداية.
لذلك تم اختيار أرابيدوبسي ثاليانا،وهو كائن نباتي نموذجي، كنوع من النباتات المستهدفة لاختبار تطبيق آلة تحميل اللمس التلقائي بالكامل للشعر. لأن هناك العديد من البنوك البذور الكبيرة المتاحة لاسترداد الجراثيم المختلفة من المسوخ وحجم المزهرة، Arabidopsis يناسب بشكل جيد إلى المساحة المتاحة في الجرف النمو شنت مع نموذج K1 آلة اللمس.
يتكون الجهاز الآلي للمس طراز K1 من ثلاثة مكونات رئيسية: (1) رف معدني على شكل حرف H يتكون من اثنين من المحركات الخطية التي يقودها الحزام، (2) الأسلحة المعدنية الروبوتية المجهزة بفرش الشعر، و (3) وحدة تحكم. لآلة لمس نموذج K1 مخصصة، كل وحدة محور X / Y يتكون من واحد حزام يحركها دليل السكك الحديدية، وكتل الشرائح اثنين (الأحمر) ومحرك واحد 57 السائر (مثبتة مسبقا وقابلة للفك) (الشكل1A،B). يسمح المحرك الأفقي العلوي للذراع المعدنية الروبوتية بالتحرك أفقياً ويساراً، ويسمح المحرك الخطي ذو الحزام العمودي السفلي بتحريك الذراع المعدنية الروبوتية صعوداً وهبوطاً رأسياً (الشكل1B، الشكل 2A) ). تم تركيب أربعة أذرع روبوتية قابلة للفك على الموضع العمودي (الشكل1C، الشكل 2B). وكانت أربع فرش شعر الإنسان ملزمة إلى أربعة الأسلحة الروبوتية، على التوالي (الشكل1C، الشكل 2باء). يتم وضع علامة على جميع الأجزاء الميكانيكية لبناء آلة اللمس K1 النموذجية بخط غامق أدناه في الشكل 1C (انظر أيضًا جدول المواد).
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis هو استجابة نمو النبات معقدة نحو الاضطرابات الميكانيكية، والذي ينطوي على شبكة من الإشارات الخلوية وعمل الهرمونات النباتية. هو نتيجة للتطور التكيفي للنباتات للبقاء على قيد الحياة في ظل الظروف البيئية غير المرغوب فيها25،26. وقد تم اختيار لمسة ميكان?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة المنح التالية: 31370315، 31570187، 31870231 (المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين)، 16100318، 661613، 16101114، 16103615، 16103817، AoE/M-403/16 (RGC من هونغ كونغ). يود المؤلفون أن يشكروا جو فنغ الدقة والأتمتة التكنولوجيا المحدودة (شنتشن، الصين) لعرضها من العديد من المخططات المبينة في الشكل1.
كما يود المؤلفان أن يشكرا س. ك. تشيونغ ودبليو سي لي على مساهمتهما في تطوير آلة التحميل ذات القوة اللمسية.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. . The Flowering Process. , (1963).
- Darwin, C. . The Power of Movement in Plants. , (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
