Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie
Summary
De gepresenteerde diagnostische FL-DNA kit is een tijdbesparende en gebruiksvriendelijke methode om de betrouwbare waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van colorectale kankerlaesies te bepalen.
Abstract
Tegenwoordig kan ontlasting DNA worden geïsoleerd en geanalyseerd door verschillende methoden. De lange fragmenten van DNA in ontlasting kunnen worden gedetecteerd door een qPCR-test, die een betrouwbare waarschijnlijkheid biedt van de aanwezigheid van pre-neoplastische of neoplastische colorectale laesies. Deze methode, genaamd fluorescentie lang DNA (FL-DNA), is een snelle, niet-invasieve procedure die een verbetering is ten opzichte van het primaire preventiesysteem. Deze methode is gebaseerd op de evaluatie van fecale DNA-integriteit door kwantitatieve versterking van specifieke doelen van genomisch DNA. Met name de evaluatie van DNA-fragmenten langer dan 200 bp maakt detectie van patiënten met colorectale laesies met een zeer hoge specificiteit mogelijk. Dit systeem en alle momenteel beschikbare dna-tests met ontlasting geven echter een aantal algemene problemen die moeten worden aangepakt (bijvoorbeeld de frequentie waarop tests moeten worden uitgevoerd en een optimaal aantal ontlastingsmonsters die op elk tijdstip voor elk individu worden verzameld). Het belangrijkste voordeel van FL-DNA is echter de mogelijkheid om het te gebruiken in combinatie met een test die momenteel wordt gebruikt in het CRC-screeningprogramma, bekend als de immunochemische fecale occulte bloedtest (iFOBT). Beide tests kunnen namelijk op hetzelfde monster worden uitgevoerd, waardoor de kosten worden verlaagd en een betere voorspelling wordt gedaan van de uiteindelijke aanwezigheid van colorectale laesies.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is afgeleid van een multi-step proces waarbij gezond epitheel zich langzaam ontwikkelt tot adenomen of poliepen, die in de loop van de tijd uitgroeien tot kwaadaardige carcinomen1,2. Ondanks het hoge incidentiepercentage van CRC is er de afgelopentienjaar een neerwaartse trend in het percentage sterfgevallen waargenomen . Inderdaad, vroege diagnostische instrumenten die in screeningsprogramma’s zijn aangenomen, hebben geleid tot vroegtijdige opsporing en verwijdering van pre-neoplastische adenomen of poliepen4. Echter, vanwege de verschillende technische limieten, geen van deze methoden is optimaal. Om de gevoeligheid en specificiteit te verbeteren, zijn veel dna-tests met ontlasting alleen of in combinatie met de huidige routinediagnosetests5,6voorgesteld .
Typisch, gezonde slijmvlies werpt in de fecale stroom apoptotische colonocyten, terwijl zieke slijmvlies exfoliates niet-apoptotische colonocyten. Fragmenten van 200 bp of meer in lengte karakteriseren niet-apoptotisch DNA. Dit DNA heet lang DNA (L-DNA) en is uitgegroeid tot een bruikbare biomarker voor CRC vroege diagnose. Het L-DNA kan worden geïsoleerd van ontlasting specimen en gekwantificeerd door qPCR met behulp van een in vitro diagnostische FL-DNA kit7,8,9,10,11,12.
De test bestaat uit twee tests voor de detectie van FL-DNA fragmenten variërend van 138 bp tot 339 bp. Elke test maakt de versterking van FL-DNA (FAM) en spike-in DNA (HEX) mogelijk. Om een optimale versterking van alle fragmenten te garanderen, is de test verdeeld in twee tests (genaamd “A” en “B”). De A-test detecteert twee gebieden van exon 14 van het APC-gen (NM_001127511) en een fragment van exon 7 van het TP53-gen (NM_001276760). De B-test detecteert een fragment van exon 14 van het APC-gen (NM_001127511) en twee gebieden van exonen 5 en 8 van het TP53-gen (NM_001276760). De tests maken geen onderscheid tussen de gedetecteerde regio’s. Het spike-in DNA komt overeen met het Oncorhynchus keta zalm DNA en maakt het mogelijk om te controleren of de procedure goed is uitgevoerd en controleert op de mogelijke aanwezigheid van remmers, wat foutnegatieve resultaten kan opleveren. De FL-DNA concentratie wordt geëvalueerd door absolute kwantificering met behulp van de standaard curve methode en wordt uitgedrukt als ng / reactie.
De FL-DNA methode is een niet-invasieve en goedkope ontlasting DNA-test die, in combinatie met de immunochemische op basis van fecale occulte bloedtest (iFOBT), wordt momenteel gebruikt in CRC screening programma’s en zorgt voor betere voorspellingen van CRC en / of hoog risico adenoma laesies12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere studies hebben aangetoond dat DNA-integriteitsanalyse van ontlasting die wordt geëxtraheerd door handmatige en semi-automatische benaderingen een alternatief instrument kan zijn voor de vroegtijdige detectie van colorectale laesies7,8,9,10,11,12. Moleculaire, niet-invasieve screening tests zijn ontwikkeld door de jar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Riferimenti
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
