대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가
Summary
제시된 진단 FL-DNA 키트는 대장암 병변의 존재의 신뢰할 수 있는 확률을 결정하는 시간 절약 및 사용자 친화적 인 방법입니다.
Abstract
요즘 대변 DNA는 여러 가지 방법으로 분리되고 분석 될 수 있습니다. 대변에 있는 DNA의 긴 단편은 사전 신생물 또는 신생물 대고 병변의 존재의 믿을 수 있는 확률을 제공하는 qPCR 분석결과로 검출될 수 있습니다. 형광 긴 DNA에게 불린 이 방법은 (FL-DNA), 1 차적인 예방 시스템에 개선인 빠른, 비침범성 절차입니다. 이 방법은 게놈 DNA의 특정 표적의 정량적 증폭에 의한 배설물 DNA 무결성의 평가에 기초한다. 특히, 200 bp 보다 긴 DNA 단편의 평가는 매우 높은 특이성을 가진 대장 병변을 가진 환자의 검출을 허용합니다. 그러나, 이 시스템 및 현재 유효한 모든 발판 DNA 시험은 해결될 필요가 있는 몇몇 일반적인 문제점을 제출합니다 (예를 들면, 시험을 수행해야 하는 주파수 및 각 개별을 위한 각 시점에서 집합된 대변 견본의 최적 수). 그러나, FL-DNA의 주요 장점은 면역화학성 배설물 혈액 검사(iFOBT)로 알려진 CRC 스크리닝 프로그램에서 현재 사용되는 시험과 관련하여 이를 사용할 수 있는 가능성이다. 실제로, 두 시험은 비용을 감소시키고 대장 병변의 궁극적인 존재의 더 나은 예측을 달성하는 동일 견본에 수행될 수 있습니다.
Introduction
대장암 (CRC)은 건강한 상피가 천천히 선종 또는 폴립으로 발전하는 다단계 과정에서 파생되며, 이는 시간이 지남에 따라 악성 암으로 진행됩니다1,,2. CRC의 높은 발생률에도 불구하고, 죽음의 비율에 있는 하향 추세는 지난 10 년간 관찰되었습니다3. 실제로, 선별 프로그램에서 채택된 조기 진단 도구는 pre-neoplastic 선종 또는 폴립4의조기 발견 및 제거로 이끌어 냈습니다. 그러나 다른 기술적 한계로 인해 이러한 방법 중 어느 것도 최적입니다. 실제로, 민감도와 특이성을 향상시키기 위하여, 많은 발판 DNA 시험은 단독으로 또는 현재 일상적인 진단시험과조합하여 제안되었습니다5,6.
일반적으로 건강한 점막은 배설물 스트림 apoptotic colonocytes로 흘러 들어가는 반면, 병에 걸린 점막은 비 세포사선 대장세포가 제거됩니다. 길이가 200 bp 이상인 단편은 비-사멸 DNA를 특징짓는다. 이 DNA는 긴 DNA (L-DNA)에게 불리고 CRC 조기 진단을 위한 이용 가능한 biomarker가 되었습니다. L-DNA는 대변 시편으로부터 분리되고 체외 진단 FL-DNA,키트7,8,89,910,,11,,12를사용하여 qPCR에 의해 정량화될 수 있다.
시험은 138 bp에서 339 bp에 구역 수색하는 FL DNA 단편의 검출을 위한 2개의 실험으로 이루어져 있습니다. 각 분석법은 FL-DNA (FAM)뿐만 아니라 스파이크 인 DNA (HEX)의 증폭을 허용합니다. 모든 단편의 최적 증폭을 보장하기 위해, 시험은 두 개의 실험(“A” 및 “B”)으로 나뉘어져 있다. A 분석은 APC 유전자(NM_001127511)의 엑소14의 2개의 지구 및 TP53 유전자의 엑손 7의 단편 (NM_001276760)를 검출합니다. B 분석은 APC 유전자(NM_001127511)의 엑슨 14의 단편과 TP53 유전자의 엑소5 및 8의 2개의 영역(NM_001276760)을 검출한다. 이 해수반은 검출된 부위를 구별하지 않는다. 스파이크인 DNA는 Oncorhynchus 케타 연어 DNA에 해당하며 절차가 제대로 수행되었는지 확인하고 잘못된 부정적인 결과를 얻을 수있는 억제제의 가능한 존재를 확인합니다. FL-DNA 농도는 표준 곡선 방법을 사용하여 절대 정량화에 의해 평가되고 ng/반응으로 표현됩니다.
FL-DNA 방법은 면역화학기반 배설물 혈액검사(iFOBT)와 결합하여 현재 CRC 스크리닝 프로그램에 사용되고 CRC 및/또는 고위험 선종 병변의 더 나은 예측을 가능하게 하는 비침습적이고 저렴한 대변 DNA 검사이다12.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 연구는 수동 및 반자동 접근법에 의해 추출 된 대변의 DNA 무결성 분석이 대장 병변7,8,89,10,,,11,,12의조기 발견을위한 대체 도구를 나타낼 수 있음을 입증했다.10 분자, 비침습적 선별 검사는 대장암 의 검출을 위해 수년에 걸쳐 개발되었지만, 이?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 인정이 없습니다.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Riferimenti
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
