رصد الاستعمار البكتيري والصيانة على جذور الثاليانية العربية في نظام مائي عائم

Summary

هنا نقوم بوصف اختبار نمو النباتات المائية لتحديد وجود الأنواع وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا أثناء الاستعمار الأولي لجذور النباتات وبعد نقلها إلى بيئات نمو مختلفة.

Abstract

تشكل البكتيريا ميكروبيومات جذمور معقدة على شكل ميكروبات متفاعلة، وكائنات أكبر، والبيئة اللاأحيائية. في ظل الظروف المختبرية، يمكن أن يزيد استعمار الجذوسفير من قبل البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB) من صحة أو تطوير النباتات المضيفة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة. ومع ذلك، في البيئات الميدانية، غالباً ما لا توفر العلاجات البكتيرية مع PGPB فوائد كبيرة للمحاصيل. أحد التفسيرات هو أن هذا قد يكون بسبب فقدان PGPB أثناء التفاعلات مع الميكروبات التربة الذاتية على مدى عمر النبات. وكان من الصعب تأكيد هذه الإمكانية، لأن معظم الدراسات تركز على الاستعمار الأولي بدلا ً من الإبقاء على PGPB داخل مجتمعات الجذمور. ومن المفترض هنا أن التجمع والتعايش والحفاظ على المجتمعات البكتيرية تتشكل من خلال السمات الحتمية للبيئة الدقيقة الجذمورفيس، وأن هذه التفاعلات قد تؤثر على بقاء PGPB في البيئات الأصلية. لدراسة هذه السلوكيات، يتم تحسين اختبار نمو النبات المائي باستخدام أرابيدوبسي ثاليانا لتحديد وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا خلال الاستعمار الأولي لجذور النبات وبعد الانتقال إلى نمو مختلف البيئات. ثم يتم التحقق من إمكانية استنساخ هذا النظام وفائدته مع PGPB Pseudomonas simiaeالمدروسة جيدا . للتحقيق في كيفية وجود أنواع بكتيرية متعددة قد تؤثر على الاستعمار وديناميات الصيانة على جذر النبات، مجتمع نموذجي من ثلاث سلالات بكتيرية (Arthrobacter، Curtobacterium،وMicrobacterium الأنواع) معزولة أصلا من تم بناء الجذمورفيس الثاليا. ويتضح أن وجود هذه الأنواع البكتيرية المتنوعة يمكن قياسه باستخدام هذا الفحص المائي للنباتات والتيار اللاين، الذي يوفر بديلا ً للدراسات المجتمعية البكتيرية القائمة على التسلسل. قد تحسن الدراسات المستقبلية التي تستخدم هذا النظام فهم السلوك البكتيري في الميكروبيوم النباتية متعددة الأنواع مع مرور الوقت وفي الظروف البيئية المتغيرة.

Introduction

تدمير المحاصيل من الأمراض البكتيرية والفطرية يؤدي إلى انخفاض إنتاج الأغذية ويمكن أن تعطل بشدة الاستقرار العالمي¹. استنادا ً إلى اكتشاف أن الميكروبات في التربة المثبطة هي المسؤولة عن زيادة صحة النبات^2،سأل العلماء ما إذا كان يمكن الاستفادة من ميكروبيوم النبات لدعم نمو النبات عن طريق تعديل وجود ووفرة خاصة [ترجم للعربية ] البكتيريا التي تم العثور عليها للمساعدة في نمو النبات أو التنمية تسمى مجتمعة البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB). وفي الآونة الأخيرة، تحولت الدراسات من مجرد تحديد PGPB المحتملة إلى فهم كيف أن التفاعلات بين الممالك في التربة، حول الجذور، أو في الغلاف الجذي (المنطقة المحيطة مباشرة بما في ذلك سطح الجذر) قد تؤثر على PGPB النشاط⁴.

يمكن للاستعمار Rhizosphere من قبل PGPB زيادة الصحة أو تطوير النباتات المضيفة استجابة لعوامل الإجهاد المتنوعة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة⁵. ومع ذلك، غالباً ما تكون النتائج أكثر تغيراً في ظروف التربة الأصلية مقارنة بتلك التي لوحظت في الدفيئة والمختبرات التي يتم التحكم فيها عن كثب⁶. فرضية واحدة لهذا الاختلاف هو أن نمو أو سلوك PGPB قد تكون تمنعها بكتيريا التربة الأصلية أو الفطريات في الحقول^7،8. الآثار المفيدة من قبل بكتيريا جذمور تعتمد عموما على قدرة البكتيريا إلى 1) تحديد موقع والتحرك نحو الجذر، 2) استعمار الجذر من خلال تشكيل biofilm، و 3) التفاعل مع النبات المضيف أو مسببات الأمراض عن طريق إنتاج جزيء صغير الأيض^7،9. أي من هذه السلوكيات الاستعمارية قد تتأثر بوجود ونشاط الميكروبات المجاورة¹⁰.

قمنا بتصميم نظام لتحديد وتصور هذه المراحل الاستعمارية البكتيرية المتميزة من الجذمورسفير (الشكل1). ومن شأن هذا النهج أن ييسر الدراسات التي تحقق في سبب عدم ملاحظة صيانة الـ PGPB الطويلة الأجل في بعض الأحيان بعد نقل النباتات إلى بيئات جديدة، مثل زراعة الشتلات قبل التلقيح. تم اختيار أرابيدوبسي ثاليانا كنموذج نباتي نظراً لاستخدامه الواسع في الدراسات المختبرية وكذلك البيانات الوافرة المتاحة عن تفاعلاته الميكروبية^11. هناك ثلاث مراحل في النظام: 1) A. تاليانا النمو، 2) الاستعمار البكتيري، و 3) الصيانة البكتيرية (انظر الشكل1). لأن A. thaliana هو نبات أرضي، كان من المهم التأكد من أنه لا يعاني من الإجهاد المائي لا مبرر له في النظام المائي¹². مستوحاة من الأساليب المستخدمة من قبل هاني وآخرون¹³، وتزرع الشتلات على شبكة بلاستيكية لفصل تبادل لاطلاق النار من وسط النمو السائل. هذا النظام لا يبدو أن المساس بصحة وتطوير المضيف النبات، وأنه يحسن A. تاليانا النمو في السائل¹¹. كما يطفو تبادل لاطلاق النار النبات فوق السطح، تتعرض الجذور تماما للاستعمار من قبل البكتيريا تلقيح في وسط النمو البكتيري السائل. وهذا يسمح للبكتيريا ذات الأهمية لفحصها للاستعمار في المواد الغذائية التي هي الأكثر ملاءمة للنمو، في حين تحول الظروف للسماح للنبات لمواصلة النمو في وسط المغذيات المصممة لدعم نموها. وتشمل كلتا المرحلتين الهز المستمر لمنع أنوكسيا من الجذر¹³. يمكن تصور البكتيريا أو قياسها كميامن جذور النبات بعد نقلها إما من وسط الاستعمار أو من وسط الصيانة. هذا النظام المائي مرنة جدا، مما يسمح الظروف التجريبية والضغوط المطبقة ليتم تغييرها بسهولة اعتمادا على مصالح الباحثين.

هذه الطريقة الموصوفة مهمة في سياق مجموعة أكبر من المؤلفات حول التفاعلات النباتية والميكروب لأنه يوفر نظام قوي لدراسة هذه التفاعلات على سطح الجذر في حين يجري أيضا للتخصيص لتفضيلات النمو من بكتيريا مختلفة. مختبرات البيولوجيا النباتية في كثير من الأحيان إجراء تجارب الاستعمار النباتات الميكروب على أجار الصلبة، مما يسمح لحركة المسطحة فقط (إذا كان ذلك) من البكتيريا في حين تتطلب أيضا التلاعب المدمرة المحتملة للنباتات خلال النقل اللاحقة. وعلى النقيض من ذلك، فإن مختبرات علم الأحياء الدقيقة أعطت الأولوية في كثير من الأحيان لصحة البكتيريا ضمن تجاربها، على حساب النباتات^14،15. هذه الأولويات المختلفة للمختبرات التي تركز على النبات والميكروبيولوجيا جعلت تاريخيا من الصعب مقارنة النتائج بين هذه المجموعات، لأن كل عادة ما يحسن الظروف التجريبية لتحسين الكائن الحي من الفائدة¹⁵. نظام النمو النباتي العائم الشبكي الموصوف هنا يمنع الغمر النباتي الكامل، وهو ميزة ملحوظة للدراسات السابقة الموجهة نحو علم الأحياء الدقيقة، مع تحسين نمو البكتيريا وبقائها بشكل مؤقت لتسهيل الاستعمار. وهكذا، فإن التقييم الذي نعرضها هنا قد يعالج المخاوف من كل من علماء الأحياء النباتية (حول الإفراط في الترطيب والتلاعب عن طريق اللمس من النبات) مع تلبية معايير علماء الأحياء الدقيقة (السماح لظروف النمو البكتيرية المختلفة ومتعددة التفاعلات الأنواع)7. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون قابلاً للتكيف مع مختلف البكتيريا والنباتات والظروف البيئية.

Protocol

ملاحظة: يتم وصف الإعداد التجريبي للوضوح ويستخدم لإنشاء النتائج التمثيلية المضمنة في هذا التقرير ولكن يمكن تعديل الشروط كما هو مطلوب. وينبغي تنفيذ جميع الخطوات باستخدام معدات الوقاية الشخصية واتباع التريس المؤسسية والاتحادية للسلامة، وفقا لحالة BSL من البكتيريا المستخدمة. 1….

Representative Results

ومن المعروف أن PGPB P. simiae WCS417r تتميز جيدا لاستعمار جذور A. thaliana في الثقافة المائية. ويمكن بسهولة تصور هذه البكتيريا الفلورية الطبيعية باستخدام المجهر على جذورالشتلات بعد الاستعمار (الشكل 2). على الرغم من أنه من الممكن تصوير الطول الكامل لهذه الجذور ?…

Discussion

النباتات في جميع البيئات تتفاعل مع الآلاف إلى الملايين من البكتيريا المختلفة والفطريات^5،7. ويمكن لهذه التفاعلات أن تؤثر سلبا وإيجابا على صحة النبات، مع ما قد يترتب على ذلك من آثار على غلة المحاصيل وإنتاج الأغذية. ويشير العمل الأخير أيضاً إلى أن الاستعمار ال…

Materials

Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017