Мониторинг бактериальной колонизации и технического обслуживания на арабидопсис thaliana Корни в плавающей гидропонной системы
Summary
Здесь мы описываем гидропонный план роста исследования для количественной оценки присутствия видов и визуализации пространственного распределения бактерий во время первоначальной колонизации корней растений и после их передачи в различных средах роста.
Abstract
Бактерии образуют сложные микрофлоры корневища, сформированные взаимомикробами, взаимодействующими, более крупными организмами и абиотической средой. В лабораторных условиях, порочносферная колонизация бактериями, стимулирующими рост растений (PGPB), может повысить здоровье или развитие растений-хозяев по сравнению с неколонизованных растений. Однако, в полевых условиях, бактериальные процедуры с PGPB часто не обеспечивают существенных преимуществ для сельскохозяйственных культур. Одно из объяснений заключается в том, что это может быть связано с потерей PGPB во время взаимодействия с эндогенными микробами почвы в течение срока службы растения. Эту возможность было трудно подтвердить, так как большинство исследований сосредоточены на первоначальной колонизации, а не поддержание PGPB в rhizosphere общин. Здесь предполагается, что сборка, сосуществование и поддержание бактериальных сообществ определяются детерминированными особенностями микросреды ризосферы, и что эти взаимодействия могут повлиять на выживание PGPB в родных местах. Для изучения такого поведения, гидропонный план роста анализа оптимизирован с помощью Arabidopsis thaliana количественно и визуализировать пространственное распределение бактерий во время первоначальной колонизации корней растений и после перехода к различным ростам Средах. Воспроизводимость и полезность этой системы затем проверяются с хорошо изученным PGPB Pseudomonas simiae. Чтобы исследовать, как наличие нескольких видов бактерий может повлиять на колонизацию и динамику обслуживания на корне растения, модель сообщества из трех бактериальных штаммов (Артробактерия, Куртобактерии, и Microbacterium , и Microbacterium видов) первоначально изолированы от A. thaliana rhizosphere построен. Показано, что присутствие этих разнообразных бактериальных видов может быть измерено с помощью этого гидропонного исследования растительного языка, который обеспечивает альтернативу секвенирования основе бактериальных исследований сообщества. Будущие исследования с использованием этой системы могут улучшить понимание бактериального поведения в многовидовых микробиомах растений с течением времени и в меняющихся условиях окружающей среды.
Introduction
Уничтожение сельскохозяйственных культур бактериальными и грибковыми заболеваниями приводит к снижению производства продуктов питания и может серьезно нарушить глобальную стабильность1. Основываясь на открытии, что микробы в подавляющих почвах несут ответственность за повышение здоровья растений2, ученые спросили, может ли микробиом растений быть использованы для поддержки роста растений путем изменения присутствия и изобилия частности бактериальных видов3. Бактерии, найденные для помощи в росте растений или развитии, коллективно называются бактериями, способствующими росту растений (PGPB). В последнее время исследования перешли от простого выявления потенциальных PGPB к пониманию того, как взаимодействие между царством в почве, вокруг корней, или в rhizosphere (область, непосредственно окружающая и в ключая корневую поверхность) может влиять на PGPB деятельность4.
Колонизация rhizosphere PGPB может увеличить здоровье или развитие растений хозяина в ответ на различные стрессоры по отношению к неколонизованных растений5. Однако, результаты часто более переменны в родных условиях почвы посравнению с теми, которые наблюдаются в тесно контролируемых тепличных и лабораторных условиях 6. Одна из гипотез для этого различия заключается в том, что рост или поведение PGPB может быть ингибирована родной почвенных бактерий или грибов в полях7,8. Благотворное воздействие rhizosphere бактерий обычно зависит от способности бактерий 1) найти и двигаться к корню, 2) колонизировать корень через биопленки формирования, и 3) взаимодействовать с принимающей растений или патогенов через производство малых молекул метаболитов7,9. Любое из этих колонизации поведения могут быть затронуты наличием и активностью соседних микробов10.
Мы разработали систему количественной оценки и визуализации этих различных этапов бактериальной колонизации ризосферы(рисунок 1). Этот подход облегчит исследования, исследующие, почему долгосрочное техническое обслуживание PGPB иногда не наблюдается после переноса растений в новые среды, например, во время посадки предварительно привитых саженцев. Arabidopsis thaliana, как были выбраны в качестве модели растений из-за его широкого использования в лабораторных исследованиях, а также достаточно данных о его микробных взаимодействий11. Есть три этапа в системе: 1. A. thaliana роста, 2) бактериальной колонизации, и 3) бактериального обслуживания (см. Рисунок 1). Поскольку А. Талиана является наземным растением, было важно, чтобы он не страдал неоправданным водным стрессом в гидропонной системе12. Вдохновленные методами, используемыми Haney et al.13,саженцы выращиваются на пластиковой сетке, чтобы отделить побег от жидкой среды роста. Эта система, как представляется, не ставит под угрозу здоровье и развитие хозяина растения, и это улучшает рост A. thaliana в жидкости11. Как завод стрелять плавает над поверхностью, корни полностью подвержены колонизации бактериями прививки в жидкой бактериальной среды роста. Это позволяет бактерии, представляющие интерес, которые будут рассмотрены для колонизации питательных веществ, которые являются наиболее благоприятными для роста, в то время как изменение условий, чтобы позволить заводу продолжать расти в питательной среде, предназначенной для поддержки его роста. Оба этапа включают устойчивое встряхивание, чтобы предотвратить аноксию корня13. Бактерии могут быть визуализированы или количественно из корней растений после передачи либо из колонизации среды или поддержания среды. Эта гидропоника очень гибкая, что позволяет легко изменять экспериментальные условия и прикладные напряжения в зависимости от интересов исследователей.
Этот описанный метод имеет важное значение в контексте более широкого тела литературы о растительно-микробных взаимодействий, поскольку он обеспечивает надежную систему для изучения этих взаимодействий на корневой поверхности, а также настраиваемый на предпочтения роста различных бактерий. Лаборатории биологии растений часто выполняют эксперименты по колонизации растений и микробов на твердом агаре, что позволяет проводить только планарное движение (если это) бактерий, требуя при этом потенциально разрушительных манипуляций растений во время последующей передачи. В отличие от микробиологических лабораторий часто приоритеты здоровья бактерий в рамках своих экспериментов, в ущерб растениям14,15. Эти различные приоритеты растений и микробиологии ориентированных лабораторий исторически затрудняет сравнение результатов между этими группами, так как каждый из них обычно оптимизирует экспериментальные условия для оптимизации их организм интересов15. Описанная здесь система плавающей сетки растений предотвращает полное погружение растений, что является заметным преимуществом для предыдущих исследований, ориентированных на микробиологию, а также временно оптимизирует рост и выживание бактерий для содействия колонизации. Таким образом, анализ, который мы представляем здесь, может решить проблемы как биологов растений (о чрезмерной гидратации и тактильных манипуляций завода), удовлетворяя при этом критериям микробиологов (с учетом различных условий роста бактерий и нескольких видовых взаимодействий)7. Этот протокол предназначен для адаптивной для использования с различными бактериями, растениями и условиями окружающей среды.
Protocol
Representative Results
Discussion
Растения во всех средах взаимодействуют с тысячамии миллионами различных бактерий и грибов 5,7. Такое взаимодействие может оказать негативное и положительное воздействие на здоровье растений, что может оказать потенциальное воздействие на урожайность ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана научно-исследовательскими фондами, предоставленными Департаментом энергетических биологических и экологических исследований (DOE-BER 0000217519 E.A.S.), Национальным научным фондом (INSPIRE IOS-1343020 e.A.S.). SLH также была поддержана Национальным научным фондом Стипендиат стипендий. Мы благодарим доктора Джеффри Дангл за предоставление бактериальных штаммов и бесценное понимание. Мы благодарим д-ра Эндрю Кляйна и Мэтью Джей Пауэрса за экспериментальные предложения. Наконец, SLH хотел бы поблагодарить связи в социальных сетях за напоминание нам о том, что распространение науки является привилегией и ответственностью, особенно с помощью творческих и доступных средств.
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
Riferimenti
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetica. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
