在浮动水培系统中监测阿拉伯菌的殖民化与维护
Summary
在这里,我们描述了一种水培植物生长测定,用于量化物种存在,并可视化细菌在植物根系初始殖民化期间和转移到不同生长环境后的空间分布。
Abstract
细菌形成复杂的根系层微生物群落,由相互作用的微生物、较大的生物体和非生物环境形成。在实验室条件下,植物生长促进细菌(PGPB)的根圈殖民化可以相对于非殖民化植物增加宿主植物的健康或发育。然而,在田间环境中,使用PGPB进行细菌处理通常不会给作物带来实质性的好处。一种解释是,这可能是由于在植物寿命期间与内源性土壤微生物相互作用时PGPB的丧失。这种可能性一直难以证实,因为大多数研究侧重于最初的殖民化,而不是根圈社区内PGPB的维持。这里假设细菌群落的组装、共存和维护是由根生圈微环境的确定性特征决定的,这些相互作用可能会影响PGPB在原生环境中的生存。为了研究这些行为,使用阿拉伯植物生长测定对水培植物生长测定进行了优化,以量化和可视化植物根系初始殖民化和转移到不同生长后的细菌空间分布环境。该系统的可重复性和实用性,然后验证与精心研究的PGPB伪多尼纳斯模拟。研究多种细菌物种的存在如何影响植物根系的殖民化和维护动力学,三种细菌菌株(一种阿尔氏杆菌、柯氏杆菌和微细菌)的模型群落物种)最初与A.thaliana根生球分离的构造。研究表明,这些不同的细菌物种的存在可以通过这种水培植物主量测定来测量,这为基于测序的细菌群落研究提供了替代方案。将来使用该系统的研究可以增进对多物种植物微生物群落中细菌行为的了解,以及随时间变化的环境条件。
Introduction
细菌和真菌疾病造成的作物破坏会导致粮食产量下降,并可能严重破坏全球稳定1。基于抑制土壤中的微生物对植物健康增加的发现2,科学家们询问植物微生物群落是否可以通过改变植物的存在和丰度来支持植物的生长。细菌种类3。发现有助于植物生长或发育的细菌统称为植物生长促进细菌 (PGPB)。最近,研究已从简单地识别潜在的PGPB转向了解土壤、根部周围或根圈(直接围绕和包括根表面的区域)的王国间相互作用如何影响PGPB活动4.
PGPB的根圈殖民化可以增加宿主植物的健康或发育,以应对相对于非殖民化植物的不同压力5。然而,结果在原生土壤条件下往往比在严格控制的温室和实验室环境中观察到的结果多变。这种差异的一个假设是,PGPB的生长或行为可能被原生土壤细菌或真菌在田地7,8抑制。根圈细菌的有益作用通常取决于细菌1)定位和向根部移动的能力,2)通过生物膜形成殖民根部,3)通过生产小分子与宿主植物或病原体相互作用代谢物7,9。任何这些殖民行为都可能受到邻近微生物10的存在和活动的影响。
我们设计了一个系统来量化和可视化根生球的这些独特的细菌殖民化阶段(图1)。这种方法将有助于研究为什么在植物转移到新环境(如接种前幼苗种植期间)后,有时无法观察到长期的PGPB维持。阿拉伯植物被选作植物模型,因为它在实验室研究中的广泛应用,以及关于其微生物相互作用的充分数据11。系统中有三个阶段:1) A. thaliana生长,2) 细菌殖民化,和 3) 细菌维护(参见图 1)。由于A.thaliana是陆地植物,因此必须确保它在水培系统12中不会遭受不必要的水压。受Haney等人13年使用的方法的启发,幼苗在塑料网中生长,将芽与液体生长介质分离。该系统似乎不会损害植物宿主的健康和发展,它提高了液体11的A.thaliana生长。当植物芽漂浮在表面之上时,根部完全暴露在细菌的殖民化中,这些细菌被接种到液体细菌生长培养基中。这允许对感兴趣的细菌进行殖民化,以在最有利于生长的营养物质中殖民化,然后改变条件,使植物在营养介质中继续生长,以支持其生长。两个阶段包括稳定摇动,以防止根13的缺氧。细菌可以从从殖民化介质或维护介质转移后从植物根进行可视化或量化。这种水培系统非常灵活,允许实验条件和应用应力根据研究人员的兴趣轻松改变。
在关于植物-微生物相互作用的文献中,这种描述的方法非常重要,因为它提供了一个强大的系统,用于研究根表面的这些相互作用,同时还可以根据植物-微生物的生长偏好进行定制。不同的细菌。植物生物学实验室经常在固体琼脂上进行植物微生物殖民化实验,只允许细菌的平面运动(如果是的话),同时要求在随后转移过程中对植物进行潜在的破坏性操作。相比之下,微生物实验室经常在实验中优先考虑细菌的健康,这不利于植物14、15。以植物和微生物为重点的实验室的这些不同优先级历来使得很难比较这些组之间的结果,因为每个组通常优化实验条件以优化其感兴趣的生物体。此处描述的浮网-植物生长系统可防止植物完全浸没,这是以往以微生物学为导向的研究的显著优势,同时还暂时优化了细菌的生长和存活,以促进殖民化。因此,我们在这里的测定可以解决植物生物学家的担忧(关于植物的过度水分和触觉操纵),同时满足微生物学家的标准(允许不同的细菌生长条件和多重物种的相互作用)7.该协议旨在适应各种细菌、植物和环境条件。
Protocol
Representative Results
Discussion
所有环境中的植物与数千到数百万种不同的细菌和真菌相互作用5,7。这些相互作用可能对植物健康产生消极和积极的影响,对作物产量和粮食生产有潜在影响。最近的工作还表明,在田间试验中,PGPB对作物的可变殖民化可能是不可预测的植物规模和作物产量的原因。了解这些相互作用背后的机制可能使我们能够直接操纵植物相关的微生物?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了能源生物和环境研究部(DOE-BER 0000217519至E.A.S.)、国家科学基金会(INSPIRE IOS-1343020至E.A.S)提供的研究基金的支持。SLH还得到了国家科学基金会研究生研究奖学金计划的支持。我们感谢Jeffery Dangl博士提供细菌菌株和宝贵的洞察力。我们感谢安德鲁·克莱因博士和马修·鲍尔斯的实验建议。最后,SLH感谢社交媒体上的联系提醒我们,传播科学是一种特权和责任,特别是通过创造性和无障碍手段。
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
Riferimenti
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