Monitoring van bacteriële kolonisatie en onderhoud op Arabidopsis thaliana wortels in een drijvend Hydroponisch systeem

Summary

Hier beschrijven we een hydroponische plantengroei test om de aanwezigheid van soorten te kwantificeren en de ruimtelijke verdeling van bacteriën te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na hun overdracht in verschillende groei omgevingen.

Abstract

Bacteriën vormen complexe rizosfeer microbioom gevormd door het interageren van microben, grotere organismen en de abiotische omgeving. Onder laboratoriumomstandigheden kan de kolonisatie van rizosfeer door plantengroeibevorderende bacteriën (pgpb) de gezondheid of de ontwikkeling van gastheerplanten ten opzichte van ongekoloniseerde planten verhogen. In de veldinstellingen bieden bacteriële behandelingen met PGPB echter vaak geen substantiële voordelen voor gewassen. Een verklaring is dat dit kan te wijten zijn aan verlies van de PGPB tijdens interacties met endogene grond microben over de levensduur van de plant. Deze mogelijkheid was moeilijk te bevestigen, omdat de meeste studies zich richten op de initiële kolonisatie in plaats van het onderhoud van pgpb binnen rizosfeer communities. Het is hier veronderstelde dat de assemblage, coëxistentie, en het onderhoud van bacteriële Gemeenschappen worden gevormd door deterministische kenmerken van de rizosfeer micro omgeving, en dat deze interacties kunnen invloed hebben op de overleving van pgpb in native Settings. Om dit gedrag te bestuderen, wordt een hydrocultuur plant-growth assay geoptimaliseerd met behulp van Arabidopsis thaliana om de ruimtelijke verdeling van bacteriën te kwantificeren en te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na overdracht naar verschillende groei Omgevingen. De reproduceerbaarheid en het nut van dit systeem worden vervolgens gevalideerd met de goed bestudeerde PGPB Pseudomonas simiae. Om te onderzoeken hoe de aanwezigheid van meerdere bacteriesoorten de kolonisatie en de onderhouds dynamiek op de wortel van de plant kan beïnvloeden, een model Gemeenschap van drie bacteriële stammen (een Arthrobacter, Curtobacteriumen micro bacterie soorten) oorspronkelijk geïsoleerd uit de A. thaliana rizosfeer is geconstrueerd. Het is aangetoond dat de aanwezigheid van deze verschillende bacteriesoorten kan worden gemeten met behulp van deze hydrocultuur plant-maintanence Assay, die een alternatief biedt voor op sequentiëren gebaseerde bacteriële Gemeenschaps studies. Toekomstige studies met behulp van dit systeem kunnen het begrip van bacterieel gedrag in diepte plant microbioom na verloop van tijd en in veranderende omgevingsomstandigheden verbeteren.

Introduction

Gewasvernietiging door bacteriële en schimmelziekten resulteert in een verlaagde voedselproductie en kan de mondiale stabiliteit ernstig verstoren¹. Op basis van de ontdekking dat microben in onderdrukkende bodems verantwoordelijk zijn voor het verhogen van de plantengezondheid², hebben wetenschappers gevraagd of de plant-microbiome kan worden ingezet om de plantengroei te ondersteunen door de aanwezigheid en overvloed van bepaalde bacteriesoorten³. Bacteriën gevonden om te helpen bij de groei van planten of ontwikkeling worden gezamenlijk genoemd plant groeibevorderende bacteriën (PGPB). Meer recentelijk zijn studies verschoven van het simpelweg identificeren van potentiële pgpb om te begrijpen hoe interkingdom-interacties in de bodem, rond wortels of in de rizosfeer (het gebied direct rond en inclusief het worteloppervlak) kunnen beïnvloeden pgpb activiteit⁴.

De kolonisatie van rhizosphere door PGPB kan de gezondheid of de ontwikkeling van gastheerplanten verhogen als reactie op diverse stressoren ten opzichte van ongekoloniseerde planten⁵. Echter, resultaten zijn vaak meer variabel in inheemse bodemomstandigheden in vergelijking met die waargenomen in de streng gecontroleerde kas en laboratorium instellingen⁶. Een hypothese voor dit verschil is dat de groei of het gedrag van pgpb kan worden geremd door inheemse bodembacteriën of schimmels in de velden^7,8. Gunstige effecten door rizosfeer bacteriën in het algemeen afhangen van het vermogen van de bacteriën 1) lokaliseren en verplaatsen naar de wortel, 2) koloniseren de wortel door middel van biofilm vorming, en 3) interactie met de gastheerplant of pathogenen via de productie van kleine molecule de metabolieten^7,9. Elk van deze kolonisatie gedrag kan worden beïnvloed door de aanwezigheid en de activiteit van naburige microben¹⁰.

We ontwierpen een systeem om deze verschillende bacteriële kolonisatie stadia van de rizosfeer te kwantificeren en te visualiseren (Figuur 1). Deze aanpak vergemakkelijkt studies die onderzoeken waarom het onderhoud op lange termijn van PGPB soms niet wordt waargenomen na de overdracht van planten in nieuwe omgevingen, zoals tijdens het planten van voorgeënt zaailingen. Arabidopsis thaliana as werden gekozen als een plant model als gevolg van het uitgebreide gebruik in laboratoriumonderzoek, evenals de ruime gegevens beschikbaar over de microbiële interacties¹¹. Er zijn drie fasen in het systeem: 1) A. thaliana groei, 2) bacteriële kolonisatie, en 3) bacteriële onderhoud (Zie Figuur 1). Omdat a. thaliana een terrestrische plant is, was het belangrijk om ervoor te zorgen dat het niet onnodig waterstress leed in het hydroponische systeem¹². Geïnspireerd door de methoden die Haney et al.¹³gebruikt, worden de zaailingen geteeld op kunststof gaas om de opname van het vloeistof groeimedium te scheiden. Dit systeem lijkt niet in gevaar te brengen de gezondheid en de ontwikkeling van de gastheer van de plant, en het verbetert A. thaliana groei in vloeistof¹¹. Naarmate de plant zweeft boven het oppervlak, worden de wortels volledig blootgesteld aan kolonisatie door bacteriën geïnocculeerd in het vloeibare bacteriegroei medium. Dit maakt het mogelijk bacteriën van belang te worden onderzocht voor kolonisatie in voedingsstoffen die het meest bevorderlijk zijn voor groei, terwijl vervolgens verschuiving voorwaarden zodat de plant te blijven groeien in een nutriënt medium ontworpen om de groei te ondersteunen. Beide stadia omvatten gestage schudden om Anoxie van de wortel¹³te voorkomen. Bacteriën kunnen worden gevisualiseerd of becijferd vanaf de wortels van de plant na overdracht van ofwel de kolonisatie medium of het onderhouds medium. Dit hydroponische systeem is zeer flexibel, waardoor experimentele omstandigheden en toegepaste spanningen gemakkelijk kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van de interesses van de onderzoekers.

Deze beschreven methode is belangrijk in de context van de grotere hoeveelheid literatuur over Plant-microbe interacties omdat het een robuust systeem biedt voor het bestuderen van deze interacties op het worteloppervlak, terwijl het ook aanpasbaar is aan de groei voorkeuren van verschillende bacteriën. Plant biologie Labs voeren vaak plantaardige kolonisatie experimenten uit op massieve agar, waardoor alleen planaire beweging (als dat) van bacteriën mogelijk is, terwijl ook de mogelijk destructieve manipulatie van planten tijdens de daaropvolgende overdracht nodig is. Microbiologie Labs daarentegen hebben vaak de gezondheid van de bacteriën in hun experimenten geprioriteerde, ten koste van de planten^14,15. Deze verschillende prioriteiten van de plant-en microbiologie-gerichte laboratoria hebben het historisch moeilijk gemaakt om de resultaten tussen deze groepen te vergelijken, omdat elk de experimentele omstandigheden optimaliseert om hun organisme van belang¹⁵te optimaliseren. Het floating-mesh-plant-growth-systeem dat hier wordt beschreven, voorkomt volledige plant onderdompeling, een opmerkelijk voordeel van eerdere microbiologie georiënteerde studies, terwijl het ook tijdelijk de groei en overleving van bacteriën optimaliseert om de kolonisatie te vergemakkelijken. De test die we hier presenteren, kan dus betrekking hebben op de bezorgdheid van beide planten biologen (over overmatige hydratatie en tactiele manipulatie van de plant), terwijl ze voldoen aan de criteria van microbiologen (waardoor verschillende bacteriële groeiomstandigheden en meerdere interacties van soorten)⁷. Dit protocol is ontworpen om te worden aangepast voor gebruik met verschillende bacteriën, planten en omgevingscondities.

Protocol

Opmerking: de experimentele Setup wordt beschreven voor duidelijkheid en gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten die zijn opgenomen in dit rapport, maar de voorwaarden kunnen worden gewijzigd zoals gewenst. Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van PBM en na institutionele en federale reccomendations voor de veiligheid, volgens de BSL status van de gebruikte bacteriën. 1. karakterisering van bacteriën Bepaal de morfologie van bacteriën op het groei…

Representative Results

De goed gekarakteriseerde PGPB P. simiae WCS417r staat erom bekend de wortels van A. thaliana te koloniseren in de hydroponische cultuur. Deze natuurlijk fluorescerende bacterie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van microscopie op de wortels van zaailingen na kolonisatie (Figuur 2). Hoewel het mogelijk is om de volledige lengte van deze A. thaliana zaailingen ‘ (4 – 6 mm lengte) wortels te maken, zou dit voor veel p…

Discussion

Planten in alle omgevingen communiceren met duizenden tot miljoenen verschillende bacteriën en schimmels,^5,7. Deze interacties kunnen een negatieve en positieve invloed hebben op de gezondheid van de plant, met potentiële effecten op gewasopbrengst en voedselproductie. Recent werk suggereert ook dat een variabele kolonisatie van gewassen door PGPBs kan duiden op onvoorspelbare plantgrootte en gewasopbrengst in veldproeven²². Het begrijpe…

Materials

Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017